Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Forskning i vårt labb stöddes av Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universitetet München, tyska Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Medical Infektion Genomics&quot; initiativ ( 0315834C).

1. Förberedelser för LCV Isolering <ol><li> Streak ut Legionella pneumophila producera DsRed-Express 13,14 från glycerol bestånd CYE agarplattor med 5 ng / ml kloramfenikol (Cam) fyra dagar innan LCV isolering. Inkubera bakterierna vid 37 ° C. </li><li> Seed ut 1 x 10 7 D. discoideum producerar GFP-kalnexin eller RAW264.7 murina makrofager i 75 cm 2 vävnadsodlingsflaskor en dag tidigare infektion. Använda 10 ml HL5 medium med 20 pg / ml G418 för D. discoid...

<ol>
	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

I motsats till tidigare publicerade metoder, är detta protokoll baserat på två steg, först genom en uppdelning av lätta nyttofordon med en immuno-magnetiska tillvägagångssättet, och den andra, rening av lätta nyttofordon genom densitetsgradientcentrifugering. Lastfordonets isolering kan enkelt följas genom fluorescensmikroskopi, när antingen fluorescensmärkta bakterier och GFP-producerande celler eller antikroppsfärgning används. Det protokoll som beskrivits här är en enkel, okomplicerad metod, som resul...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

Den opportunistiska patogener Legionella pneumophila är en amöba-resistent bakterie, som också replikerar i alveolära makrofager vilket gör att svår lunginflammation &quot;legionärssjukan&quot; 1. I protozoiska och däggdjur fagocyter, L. pneumophila utnyttjar en konserverad mekanism för att bilda en specifik, replikationsdefekta tillåtande fack, den &quot;Legionella-innehållande vakuolen&quot; (LCV). Lastfordonets bildning kräver bakteriella ICM / Dot typ IV sekretionssystem (T4SS), som translokerar så många som 275 &quot;effektor&quot;-proteiner i värdceller. Effektorerna manipulera värdproteiner samt lipider och kommunicera med sekretoriska, endosomala och mitokondriell organeller 2-4. Bildningen av lätta nyttofordon representerar en komplex, robust och redundanta process, som är svår att få grepp på en reduktionistiskt sätt. En integrerad strategi behövs för att fullständigt förstå LCV bildning, inklusive en global analys av vägenogen-värd faktor interaktioner och deras temporala och spatiala dynamik. Som ett första steg mot detta mål är intakta lätta nyttofordon renas och analyseras av proteomik och lipidomics. Kompositionen och bildning av patogen-innehållande vakuoler har undersökts av proteomikanalys användning av vätskekromatografi eller 2-D gelelektroföres kopplad till masspektrometri. Vakuoler isolerade från antingen den sociala jorden amöban Dictyostelium discoideum eller däggdjur fagocyter hyste Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 eller Legionella spp. 10. De reningsprotokoll användes i dessa studier är tidskrävande och omständlig, eftersom de kräver t.ex. elektronmikroskop för att analysera LCV morfologi, integritet och renhet. Dessutom inte utnyttjar dessa protokoll inte särdrag patogenen vakuolen För ENrichment. Metoden som presenteras här övervinner dessa begränsningar genom att använda D. discoideum producera en fluorescerande markör lastfordonets och genom att rikta den bakteriella effektorprotein SidC, som selektivt förankra till lastfordonets membranet genom bindning till fosfatidylinositol 4-fosfat (PtdIns (4) P) 3,11. Lätta nyttofordon är anrikade i ett första steg genom immuno-magnetisk separation med användning av en affinitets-renad primär antikropp mot SidC och en sekundär antikropp kopplad till magnetiska pärlor, följt i ett andra steg genom en klassisk Histodenz densitetsgradientcentrifugering 12,13 (fig. 1) . En proteomanalys studie av isolerade lätta nyttofordon från D. discoideum visade mer än 560 värdcellproteiner, inklusive proteiner i samband med fagocytiska blåsor, mitokondrier, ER och Golgi, liksom flera GTPases, som inte varit inblandade i LCV formation före den 13. Lätta nyttofordon berikad och renades medprotokoll som beskrivs här kan vidare analyseras med mikroskopi (immunofluorescens, elektronmikroskopi), biokemiska metoder (Western blot) och proteomik eller lipidomic metoder.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Denna artikel beskriver ett förfarande för isolering och rening av intakt<em&gt; Legionella</em&gt; Som innehåller vakuoler (lätta nyttofordon) från amöbor och makrofager. Den två-stegs protokoll innefattar lastfordonets anrikning av immuno-magnetisk separation med användning av en antikropp mot en bakteriell lastfordonets markör och ytterligare rening genom densitetsgradientcentrifugering.

Rening av patogener vakuoler från<em&gt; Legionella</em&gt;-Infekterade Fagocyter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Program för bakteriell patogen Detection och provning av antimikrobiell resistens från blododlingar

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Rening och visualisering av lipopolysackarid från Gram-negativa bakterier genom varm vattenhaltig fenol Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell videomikroskopi av svamppatogen Fagocytos

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-medierad Isothermal Amplification (LAMP) Analyser för de artspecifika Upptäckt av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infekterar Kycklingar

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Rening från Intracellulärt Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering, karakterisering och rening av makrofager från vävnader som påverkas av fetma-relaterade Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Rening av extracellulära innebörder, inklusive afrikanska, från blod av anjon-värmeväxlare (Diethylaminoethyl-cellulosa kolumner)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...