Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Laboratuarımızda Araştırma Max von Pettenkofer Enstitüsü, Ludwig-Maximilians Üniversitesi Münih, Alman Araştırma Topluluğu (DFG, HI 1511/3-1) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Tıbbi Enfeksiyon Genomics&quot; inisiyatifi tarafından desteklenmiştir ( 0315834C).

1. LCV İzolasyon hazırlıkları <ol><li> Legionella pneumophila LCV izolasyon önce 5 mg / ml kloramfenikol (Cam) dört gün CYE Agar plaklarda gliserol stoklarından DsRed-Express 13,14 üreten dışarı Streak. 37 az bakteri inkübe ° C. </li><li> 1 x 10 üzerinden 7 Tohum D. GFP-calnexin veya 75 cm 2 doku kültürü RAW264.7 fare makrofajları üreten discoideum bir gün önce enfeksiyon matara. 20 ug / ml G418 D. için ile 10 ml HL5 orta kulla...

<ol>
	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

Daha önce yayınlanmış yöntem tersine, bu protokolü iki aşamada, birinci bir immüno-manyetik bir yaklaşım tarafından LCVs ayrılması, ve ikinci olarak, yoğunluk gradyanı santrifüjle LCVs ile saflaştırma dayanmaktadır. LCV izolasyon kolayca floresan ile işaretlenmiş bakteri ve GFP üreten hücreleri veya antikor boyama da kullanılan floresan mikroskobu ile takip edilebilir. Burada açıklanan protokol yüksek saflıkta ile LCVs zenginleşmesine neden basit, düz ileri yöntemdir. Önemli olarak, homoj...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

Fırsatçı patojen Legionella pneumophila ayrıca, böylece ciddi pnömoni &quot;Lejyoner hastalığı&quot; 1 neden alveoler makrofajlarda çoğaltır bir amip dirençli bakteri vardır. Protozoon ve memeli fagositler, L. pneumophila belirli bir, çoğaltma-müsamahakar bölmesi, &quot;Legionella içeren vakuol&quot; (LCV) oluşturmak için korunmuş bir mekanizma kullanır. LCV oluşumu ev sahibi hücrelerin içine kadar 275 gibi &quot;efektör&quot; protein translocates bakteriyel ICM / tip IV Nokta salgılama sistemi (T4SS), gerektirir. Effektörler ana proteinler gibi yağlar işlemek ve salgı, endosome ve mitokondriyal organeller 2-4 ile iletişim kurarlar. LCVs oluşumu indirgemeci şekilde kavramak zor olan bir kompleks sağlam ve atıl işlemi temsil eder. Bütünleştirici bir yaklaşım kapsamlı yolu küresel bir analizini içeren LCV oluşumu, anlamak için gereklidirogen-konak faktörü etkileşimleri ve bunların zamansal ve mekansal dinamikleri. Bu amaca yönelik ilk adım olarak, bozulmadan LCVs saflaştırılmış ve proteomik ve lipidomics tarafından analiz edilmiştir. Bileşimi ve patojen-içeren vakuollerin oluşumu sıvı kromatografi-kitle spektrometresi ya akuple 2-D jel elektroforezi ile analiz proteomik tarafından araştırılmıştır. Sosyal toprak amip Diktiyostelyum diskodeyum ya da memeli fagositler ya izole Vakuoller Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 veya Legionella barındırmaktaydı. 10. Onlar örneğin elektron mikroskobu LCV morfolojisi, bütünlük ve saflık analiz gerektirir Ancak, bu çalışmalarda arıtma protokolü, zaman alıcı ve sıkıcı vardır. Ayrıca, bu protokoller için en patojen vakuol belirli özellikleri istismar yokrichment. Burada sunulan yöntemi D. istihdam ederek bu kısıtlamaların üstesinden Bir floresan LCV işaretleyici üreten discoideum ve bakteriyel efektör protein SidC, belirleyerek hangi seçici (PtdIns (4) P) 4-fosfat fosfatidilinositol için 3,11 bağlanarak LCV zarına çapalar. LCVs klasik bir Histodenz yoğunluk gradyanı santrifüjleme 12,13 (Şekil 1) tarafından, bir ikinci adımı takip SidC ve manyetik boncuklara bağlanan bir sekonder antikor, karşı afinitesi-saflaştırılmış primer antikor kullanılarak immüno-manyetik ayırma ile bir birinci adım zenginleştirilmiş . D. izole edilen hafif ticari araç bir proteom çalışma discoideum 13 öncesi LCV oluşumu karışmış edilmemiştir fagositik kesecikler, mitokondri, ER ve Golgi, yanı sıra çok sayıda GTPases ile ilişkili proteinler de dahil olmak üzere birden fazla 560 konak hücrenin protein, ortaya çıkardı. LCVs zenginleştirilmiş ve ile saflaştırılmışprotokolü daha mikroskobu (immunfloresan, elektron mikroskobu), biyokimyasal yöntemler (Western Blot) ve proteomik veya lipidomic yaklaşımlarla analiz edilebilir burada özetlenen.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Bu makale, bozulmamış izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır<em&gt; Legionella</emAmip ve makrofajlardan&gt; içeren vakuoller (LCVs). Iki adımlı bir protokol yoğunluk gradyanı santrifüj yoluyla bir bakteriyel LCV işaretleyici ve daha fazla arıtılmadan karşı bir antikor kullanılarak immüno-manyetik ayırma tarafından LCV zenginleştirme kapsamaktadır.

Patojen Vakuoller saflaştırılması gelen<em&gt; Legionella</em&gt;-Enfekte Fagositler

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...