Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

وأيد هذا العمل في جزء من المنح باحث (116403-RSG-09-082-01-MGO) من الجمعية الأميركية للسرطان وصناديق جماعية من ويك فورست العلوم الصحية جامعة إلى ع. وأيد DBS بواسطة منحة لجنة التحقيق الوطنية 5T32CA079448 التدريب.

1. جيل بنيات shRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تسلسل سيرنا المستهدفة (20-23 النيوكليوتيدات) بناء على معايير سبق نشرها (6) او استخدام ملقم الخوارزمية على شبكة الإنترنت، مثل &quot;سيرنا الباحث عن الهدف&quot; من Ambion وGenScript. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

هذا البروتوكول وصفا لطريقة لاسقاط الجين باستخدام shRNA ووضع تصور لتأثيره البيولوجية باستخدام التصوير bioluminescent من نمو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. الموقع هدفا لshRNA يجب أن لا تحتوي على أي من مواقع تقييد الثلاثة (BamHI، HindIII وEcoRI) المستخدمة لsubcloning. في سيناريو نادر عند...

بالإضافة إلى المعدات المختبرية التي يشيع استخدامها في الحمض النووي الريبي وتحليلات البروتين وزراعة الخلايا، ويطلب من المواد التالية والكواشف لهذا البروتوكول. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td></tr><tr><td> السلامة البيولوجية مجلس الوزراء مناسبة لاحتواء السلامة الأحيائية من المستوى 2 </td></tr><tr><td> PCR thermocycler </td></tr><tr><td> منبذة فائقة </td></tr><tr><td> التخدير التعريفي غرفة مع الزبالين isoflurane </td></tr><tr><td> الرقمية الورنية الفرجار </td></tr><tr><td> IVIS نظام التصوير </td></tr><tr><td> درجة عالية من الكفاءة DH5a كولاي </td></tr><tr><td> الانزيمات EcoRI، BamHI، وتقييد HindIII </td></tr><tr><td> T4 الحمض النووي يغاز </td></tr><tr><td> ثالث البلازميدات التعبئة والتغليف جيل الفيروسة البطيئة VSV-G، pRSV القس وpMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> قائمة المواد

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) يحول دون التعبير الجيني من قبل mRNAs الهدف المهينة على وجه التحديد. منذ اكتشاف المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) في إسكات الجينات 1، وأصبح رني أداة بحث قوية في الدراسات وظيفة الجين. بالمقارنة مع حذف الجينية، [رني بوساطة إسكات الجينات تمتلك العديد من المزايا، مثل السهولة التي تتم فيها ومدى ملاءمتها لمعظم خطوط الخلية. وقد أظهرت دراسات متعددة في تطبيقات تكنولوجيا رني في أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، جعلت تطوير تكنولوجيا مكافحة ناقلات القائم على الحمض النووي الريبي لانتاج صغير دبوس الشعر (shRNA) مدفوعا U6 أو مروج H1 على المدى الطويل والجينات محرض إسكات 2،3 ممكن. استخدامه في تركيبة مع النواقل الفيروسية وراثيا، مثل الفيروسة البطيئة، تسهل الكفاءة العالية للتسليم shRNA و / أو الاندماج في الحمض النووي الجيني للتعبير shRNA مستقر. نحن تصف detaileد الإجراء باستخدام تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على تحديد وظيفة الجينات، بما في ذلك بناء ناقلات lentiviral معربا عن shRNA، وإنتاج الفيروسة البطيئة وإصابة الخلية، والدراسات الفنية باستخدام نموذج الفأر طعم أجنبي. تم الإبلاغ عن الاستراتيجيات المختلفة في توليد بنيات shRNA. وصف بروتوكول هنا توظيف تضخيم PCR وربط 3-شظية يمكن استخدامها لمباشرة وكفاءة توليد shRNA التي تحتوي على ثوابت lentiviral دون أن تترك أي المتاخمة اضافية النوكليوتيدات لتسلسل shRNA الترميز. حيث يمكن خفض الكاسيت shRNA التعبير عن هذه الاستراتيجية التي أنشأتها من قبل إنزيمات التقييد، ويمكن بسهولة انتقلوا إلى ناقلات أخرى مع مختلف علامات الفلورسنت أو المضادات الحيوية. ويمكن استخدام الكواشف ترنسفكأيشن معظم الإنتاج التجاري في الفيروسة البطيئة. ومع ذلك، في هذا التقرير، ونحن نقدم وسيلة اقتصادية باستخدام الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار التي يمكن أن تحقق أكثر من 90٪ في كفاءة ترنسفكأيشن293T الخلايا. مقارنة التأسيسي ناقلات التعبير shRNA، نظام shRNA محرض هو مناسبة خاصة لاسقاط الجين ضروري لتكاثر الخلايا. علينا أن نبرهن على إسكات الجينات من يانغ يين 1 (YY1)، وهو الجين الورمي المحتملة في الاصابة بسرطان الثدي 4،5، من تيت، وعلى نظام shRNA محرض وآثارها على تكوين ورم. بحث باستخدام الفيروسة البطيئة يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول السلامة الاحيائية من قبل لجنة السلامة من مؤسسة الباحث. بحث باستخدام نماذج حيوانية يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام (ACUC) من مؤسسة الباحث.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) تمتلك مزايا عديدة أكثر من خروج المغلوب الجينات، واستخدمت على نطاق واسع باعتبارها أداة في دراسات الجينات الوظيفية. جعلت من اختراع تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على المدى الطويل، ومحرض ضربة قاضية الجين ممكن، وزادت أيضا في جدوى إسكات الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;.

الحمض النووي الريبي التدخل ناقلات القائم على دراسة وظيفة الجينات في سرطان

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

فيفو الناب في العضلات وظيفة الفحص

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

إنشاء والدعوة للأورام الشبكية الإنسان في الفئران أن نقص المناعة

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

و في المختبر النظام الدراسي لاستئصال ورم من الخمول وتبديل للنمو النقيلي

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

المؤشرات الحيوية في نموذج حيواني لكشف الاقتران العصبية، الدموية، والسلوكية للPTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

وسرطان المثانة نموذج مثلي للدراسات توصيل الجينات

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

موسع داخل الرغامى التنبيب لدراسة علم الأمراض وعلم وظائف الأعضاء من الرئة ماوس

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

في فيفو وفيفو السابقين المداخل لدراسة سرطان المبيض النقيلي الاستعمار من الهياكل التبانة بقعة في البريتوني الدهنية

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...