Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

Dit werk werd mede ondersteund door het Research Scholar-subsidies (116.403-RSG-09-082-01-MGO) van de American Cancer Society en intramurale fondsen van Wake Forest University Health Sciences aan GS. DBS werd ondersteund door NCI training subsidie ​​5T32CA079448.

1. Generatie van shRNA constructen <ol><li> Identificeer een siRNA-doelsequentie (20-23 nucleotiden) op basis van eerder gepubliceerde criteria 6 of gebruik een web-based algoritme server, zoals &quot;siRNA Target Finder&quot; van Ambion en GenScript. </li><li> Samenstel oligonucleotiden gebaseerd op het ontwerp van figuur 1 en voorbeeld sequenties in tabel 1. Voer PCR amplificatie met de oligonucleotiden P1 en P2 (30 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 sec, gloe...

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een methode te kloppen in een gen met behulp van shRNA en visualisering van haar biologisch effect met behulp van lichtgevende beeldvorming van de groei van tumorcellen in vivo. Het doel site van een shRNA mag niet een van de drie restrictieplaatsen bevatten (BamHI, Hindlll en EcoRI) die worden gebruikt voor subklonering. In een zeldzaam scenario wanneer een van deze sites aanwezig is, kan een extra restrictie-enzym worden gebruikt om hem te vervangen in het genereren van het construct. ...

Naast gemeenschappelijke laboratorium uitrusting voor RNA en analyseert en celkweek worden de volgende materialen en reagentia voor deze protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td></tr><tr><td> Bioveiligheid Kabinet geschikt voor Bioveiligheid inperkingsniveau 2 </td></tr><tr><td> PCR thermocycler </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> Anesthesie-inductie kamer met isofluraan aaseters </td></tr><tr><td> Digitale schuifmaat </td></tr><tr><td> IVIS imaging-systeem </td></tr><tr><td> Zeer bevoegde DH5a E. coli </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, en HindIII restrictie-enzymen </td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td></tr><tr><td> Derde generatie lentivirus verpakking plasmiden VSV-G, pRSV-Rev en pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Materialen Lijst

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA-interferentie (RNAi) remt de expressie van genen door specifiek vernederende doelwit mRNA&#39;s. Sinds de ontdekking van double-stranded kleine interferentie RNA (siRNA) in gene silencing 1, is RNAi uitgegroeid tot een krachtig onderzoeksinstrument in functie van een gen studies. Vergeleken met genetische deletie RNAi-gemedieerde silencing bezit vele voordelen, zoals het gemak waarmee het wordt uitgevoerd en geschiktheid voor de meeste cellijnen. Meerdere studies hebben aangetoond dat de toepassingen van RNAi-technologie in het kankeronderzoek. In het bijzonder is de ontwikkeling van de DNA-vector-gebaseerde technologie om kleine hairpin RNA (shRNA) gedreven door de U6 of H1 promotor te produceren gemaakt op lange termijn en induceerbaar gen zwijgen mogelijk 2,3. Het gebruik in combinatie met genetisch gemanipuleerde virale vectoren zoals lentivirus, vergemakkelijkt hoge rendement van shRNA levering en / of integratie in genomisch DNA van stabiele shRNA expressie. We beschrijven een detailed procedure met behulp van de DNA-vector-gebaseerde RNAi technologie om genfunctie, waaronder de constructie van lentivirale vectoren die shRNA, lentivirus de productie en de cel-infectie, en functionele studies met behulp van een muis xenograft model te bepalen. Diverse strategieën zijn gemeld bij het genereren van shRNA constructen. Het protocol beschreven gebruik PCR amplificatie en een 3-fragment ligatie kan worden rechtstreeks en efficiënt genereren shRNA bevattende lentivirus constructen zonder dat er extra nucleotide naast een shRNA coderende sequentie. Sinds de shRNA-expressiecassettes die door deze strategie kan worden gesneden door restrictie-enzymen, kunnen ze gemakkelijk worden verplaatst naar andere vectoren met verschillende fluorescerende of antibiotica markers. De meeste commerciële transfectie reagentia kunnen worden gebruikt in lentivirus productie. Echter, in dit rapport geven we een economische methode met behulp van calciumfosfaat neerslag die kan bereiken meer dan 90% transfectie-efficiëntie in293T cellen. Vergeleken met constitutieve shRNA expressievectoren een induceerbaar shRNA is met name geschikt voor slopen een gen essentieel celproliferatie. We tonen de gene silencing van Yin Yang 1 (YY1), een potentiële oncogen bij borstkanker 4,5, door een Tet-On induceerbaar shRNA systeem en de effecten ervan op tumorvorming. Onderzoek met behulp van lentivirus is de beoordeling en goedkeuring van een protocol inzake bioveiligheid door de bioveiligheid Comite van de instelling van een onderzoeker. Onderzoek met behulp van diermodellen is de beoordeling en goedkeuring van een dier protocol door de Animal Care en gebruik Comite (ACUC) van de instelling van een onderzoeker.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene silencing<em&gt; In vivo</em&gt;.

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Canine spierfunctie Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

Niet-invasieve Intratracheaal intubatie om te studeren de Pathologie en Fysiologie van Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo en ex vivo benaderingen van eierstokkanker uitgezaaide Kolonisatie van Milky Spot Structuren Bestudeer in peritoneale Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...