Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר המלומדת (116403-RSG-09-082-01-MgO) של האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן וקופות המיפוי של אוניברסיטת Wake Forest למדעי הבריאות ל GS. DBS נתמך על ידי NCI אימון מענק 5T32CA079448.

1. דור בונה shRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את רצף siRNA-היעד (20-23 נוקלאוטידים) על פי קריטריונים שפורסמו בעבר 6 או להשתמש בשרת מבוסס אינטרנט אלגוריתם, כגון &quot;Finder siRNA יעד&quot; מ Ambion ו GenScript. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז oligonucleotides מבוסס על העי...

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפיל הגן באמצעות shRNA ולדמיין ההשפעה הביולוגית שלה באמצעות הדמיה bioluminescent גידול תאים סרטניים in vivo. אתר היעד של shRNA לא יכילו כל אחד משלושת אתרי הגבלה (BamHI, HindIII ו EcoRI) משמש עבור subcloning. בתרחיש נדיר כאשר כל אחד מהאתרים הללו קיים, אנזים הגבלה נוספת שנ...

בנוסף ציוד מעבדה נפוצה המשמשת RNA וניתוח חלבון ו תרבית תאים, חומרים הבאים ריאגנטים נדרשים עבור פרוטוקול זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית מתאים הבלימה ברמת בטיחות ביולוגית 2 הממשלה </td></tr><tr><td> PCR thermocycler </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> הרדמה, אינדוקציה קאמרית עם אוכלי נבלות isoflurane </td></tr><tr><td> Digital Vernier קליפר </td></tr><tr><td> IVIS הדמיה המערכת </td></tr><tr><td> המוסמכות ביותר DH5a החיידק אשריכיה קולי </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, &amp; HindIII הגבלה אנזימים </td></tr><tr><td> האנזים T4 DNA </td></tr><tr><td> הדור השלישי lentivirus אריזה פלסמידים VSV-G, pRSV-Rev ו pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> רשימת חומרים

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

התערבות RNA (RNAi) מעכב ביטוי גנים על ידי mRNAs יעד משפילים במיוחד. מאז גילויו של פעמיים תקועים התערבות RNA קטן (siRNA) בגן ההשתקה 1, RNAi הפך לכלי רב עוצמה המחקר במחקרים תפקוד הגן. לעומת מחיקה גנטית, RNAi בתיווך להשתקת גנים בעל יתרונות רבים, כגון הקלות שבה היא מתבצעת והתאמתו שורות תאים ביותר. מחקרים רבים הדגימו את היישומים של טכנולוגיית RNAi בחקר הסרטן. בפרט, פיתוח טכנולוגיית ה-DNA וקטור מבוסס לייצר סיכת ראש RNA קטן (shRNA) מונע על ידי U6 או האמרגן H1 הפכה לטווח ארוך הגן מושרה להשתיק 2,3 אפשרי. השימוש בו בשילוב עם וקטורים ויראליים מהונדסים גנטית, כמו lentivirus, מקלה על יעילות גבוהה של משלוח shRNA ו / או אינטגרציה לתוך הדנ&quot;א הגנומי לביטוי shRNA יציב. אנו מתארים detaileהליך D באמצעות וקטור מבוססי טכנולוגיית ה-DNA RNAi לקבוע תפקוד הגן, כולל בנייה של וקטורים lentiviral המבטאים shRNA, ייצור lentivirus וזיהום התא, ומחקרים תפקודית באמצעות מודל xenograft העכבר. אסטרטגיות שונות דווחו ביצירת מבנים shRNA. פרוטוקול המתואר כאן העסקת הגברה PCR ו קשירת 3-שבר יכול לשמש ישירות וביעילות ליצור shRNA המכילים מבנים lentiviral מבלי לעזוב כל הצמוד נוקלאוטיד נוסף ברצף shRNA קידוד. מאז shRNA ביטוי קלטות שנוצרו על ידי אסטרטגיה זו ניתן לגזור על ידי אנזימי הגבלה, הם יכולים להעביר בקלות וקטורים אחרים עם סמנים ניאון או אנטיביוטיקה שונים. ריאגנטים transfection המסחריים יכולים לשמש בייצור lentivirus. עם זאת, בדו&quot;ח זה, אנו מספקים שיטה כלכלית באמצעות סידן זרחתי משקעים כי ניתן להשיג על יעילות transfection של 90%293T תאים. לעומת מכוננת וקטורים shRNA הביטוי, מערכת shRNA מושרה מתאים במיוחד כדי לדפוק את הגן חיוני התפשטות תאים. אנחנו מדגימים להשתקת גנים של ין יאנג 1 (YY1), oncogene פוטנציאל בסרטן השד 4,5, על ידי ט במערכת מושרה shRNA והשפעתו על היווצרות הגידול. מחקר באמצעות lentivirus מחייב סקירה ואישור פרוטוקול בטיחות ביולוגית על ידי ועדת בטיחות ביולוגית של המוסד של החוקר. מחקרים באמצעות מודלים של בעלי חיים מחייבת בדיקה ואישור של פרוטוקול בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) במוסד של החוקר.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת הגן<em&gt; In vivo</em&gt;.

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

סרטן שלפוחית ​​השתן לדגם orthotopic ג&#39;ין משלוח לימודים

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

פולשנית Intratracheal אינטובציה ללמוד פתולוגיה והפיזיולוגיה של עכבר ריאות

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...