Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
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この作業は、研究Scholarのアメリカの癌協会からの補助金（116403-RSG-09から082-01-MGO）とGSのウェイクフォレスト大学健康科学の学内資金によって部分的にサポートされていました。 DBSは、NCI訓練助成金5T32CA079448によってサポートされていました。

1。 shRNAコンストラクトの生成<ol><li>以前に発行された基準6またはそのようなAmbion社とGenScriptから&quot;siRNAのターゲットファインダー&quot;などのWebベースのアルゴリズムサーバーを使用に基づいて、siRNAを標的配列（20-23ヌクレオチド）を識別します。 </li><li> 表1の図1と例配列の設計に基づいてオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドはP1とP2（3...

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

このプロトコルは、shRNAを用いて遺伝子をノックダウンし、in vivoでの腫瘍細胞増殖の生物発光イメージングを使用して、その生物学的効果を可視化する方法について説明します。shRNAのターゲットサイトが使用される3つの制限部位のいずれか（をBamHI、HindIII及びEcoRI）を含めるべきではありませんサブクローニングのために。以下のいずれのサイトが存在するときにまれなシナ?...

RNAとタンパク質の解析や細胞培養に使用される一般的な実験装置に加えて、以下の材料および試薬は、このプロトコルが必要になります。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td>バイオセーフティレベル2の封じ込めに適したバイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td> PCRサーマルサイクラー</td></tr><tr><td>超遠心</td></tr><tr><td>イソフルランスカベンジャーによる麻酔誘導室</td></tr><tr><td>デジタルノギス</td></tr><tr><td> IVISイメージングシステム</td></tr><tr><td>有能DH5a大腸菌</td></tr><tr><td>をEcoRI、BamHI部位、及びHindIII制限酵素</td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td></tr><tr><td>第三世代レンチウイルスパッケージングプラスミド、VSV-G、PRSV-RevおよびpMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> 材料リスト

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA干渉（RNAi）が特異的に分解する標的mRNAによる遺伝子発現を阻害する。遺伝子サイレンシング1の二本鎖の小さな干渉RNA（siRNA）の発見以来、RNAiは遺伝子機能の研究において強力な研究ツールとなっています。遺伝子欠失に比べて、RNAiによる遺伝子サイレンシングは、そのようなことが行われると使いやすさと、ほとんどの細胞株への適合性など多くの利点を持っています。複数の研究は癌研究でのRNAi技術の応用を実証した。特に、U6またはH1プロモーターにより駆動される小さなヘアピンRNA（shRNA）を生成するDNAベクターベースの技術の開発が可能2,3サイレン長期および誘導性遺伝子を行いました。このようなレンチウイルスなどの遺伝子組み換えウイルスベクターと組み合わせて、その使用は、安定したshRNA発現のためにゲノムDNAにshRNAの配信、および/または統合の高効率​​を容易にします。 我々はdetaileを記述するdの手順では、shRNAは、レンチウイルスの生産と細胞感染、マウス異種移植モデルを用いた機能研究を表現するレンチウイルスベクターの構築を含む、遺伝子機能を決定するDNAベクターベースのRNAi技術を使用します。 様々な戦略がshRNAコンストラクトを生成する際に報告されている。プロトコルは、PCR増幅を採用し、3断片ライゲーションが直接かつ効率的にshRNAをコードする配列に余分な塩基の隣接を離れることなく、レンチウイルスコンストラクトをshRNAを含む生成するために使用することができますここで説明する。この戦略によって作成されたshRNAの発現カセットを制限酵素によって切断することができるので、それらは容易に異なる蛍光または抗生物質マーカーを有する他のベクターに移動​​することができます。ほとんどの市販のトランスフェクション試薬は、レンチウイルス生産に使用することができます。しかし、このレポートでは、我々は90％のトランスフェクション効率を上に実現することができますリン酸カルシウム沈殿を用いた経済的な方法を提供する293T細胞。構成のshRNA発現ベクターに比べ、誘導性のshRNAシステムは、細胞増殖に必須の遺伝子をノックダウンに特に適しています。我々は、陰陽1（YY1）、TETオン誘導shRNAのシステムおよび腫瘍形成に及ぼす影響によって乳癌4,5、の潜在的な癌遺伝子の遺伝子サイレンシングを示しています。レンチウイルスを用いた研究は、研究者の所属機関のバイオセーフティ委員会によるバイオプロトコルのレビューと承認を必要とします。動物モデルを用いた研究では、アニマルケア、動物プロトコルのレビューと承認を必要とし、研究者の機関の委員会（ACUC）を使用します。

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DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA干渉（RNAi）は遺伝子ノックアウトよりも多くの利点を有し、広範に遺伝子機能研究のツールと​​して使用されています。 DNAベクターベースのRNAi技術の発明は、長期的および誘導性遺伝子のノックダウンを可能にした、また、遺伝子サイレンシングの可能性を増加している<emin vivoでの&gt;</em&gt;。

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

ビボ犬筋肉の機能アッセイに

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

アンインビトロ</em転移性増殖に腫瘍の休眠とスイッチを研究する>システム

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

遺伝子送達研究のための同所膀胱癌モデル

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

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アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

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生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...