Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado em parte pelas Bolsas de Investigação Scholar (116403-RSG-09-082-01-MGO) da American Cancer Society e fundos intramurais de Wake Forest University Health Sciences para GS. DBS foi apoiado pelo NCI treinamento concessão 5T32CA079448.

1. Geração de Construções shRNA <ol><li> Identificar uma seqüência de siRNA-alvo (20-23 nucleotídeos) com base em critérios previamente publicados, 6 ou usar um servidor de algoritmo baseado na web, como o &quot;Finder alvo siRNA&quot; de Ambion e GenScript. </li><li> Sintetizar oligonucleótidos com base no desenho da Figura 1 e exemplo sequências na Tabela 1. Efectuar a amplificação por PCR usando o P1 e P2 oligonucleótidos (30 ciclos de desnaturação a 94 °...

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	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. 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R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Este protocolo descreve um método para derrubar um gene usando shRNA e visualizar o seu efeito biológico utilizando imagiologia bioluminescente de crescimento de células tumorais in vivo. O local de destino de um shRNA não deve conter qualquer um dos três locais de restrição (BamHI, HindIII e EcoRI) utilizado para subclonagem. Num cenário raro quando qualquer destes sítios está presente, uma enzima de restrição adicional pode ser utilizada para a substituir na geração do construto. <p class="j...

Além do equipamento de laboratório comum utilizado para análises de RNA e de proteínas e cultura de células, os seguintes materiais e reagentes necessários para este protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> Biossegurança Gabinete adequado para contenção de Biossegurança Nível 2 </td></tr><tr><td> PCR termociclador </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td></tr><tr><td> Indução anestésica-câmara com catadores isoflurano </td></tr><tr><td> Paquímetro Digital </td></tr><tr><td> IVIS Imaging System </td></tr><tr><td> Altamente competentes DH5a E. coli </td></tr><tr><td> As enzimas de restrição EcoRI, BamHI, e HindIII </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td></tr><tr><td> Terceira geração lentivírus plasmídeos embalagem VSV-G, pRSV-Rev e pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Lista de Materiais

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA de interferência (RNAi) inibe a expressão de genes por mRNAs alvo especificamente degradantes. Desde a descoberta da dupla hélice pequeno RNA de interferência (siRNA) no gene silenciamento 1, RNAi se tornou uma poderosa ferramenta de pesquisa em estudos da função gênica. Comparado com deleção genética, RNAi mediada silenciamento do gene possui muitas vantagens, tais como a facilidade com que é realizado e à sua adequação para a maioria das linhas celulares. Vários estudos têm demonstrado as aplicações da tecnologia de RNAi na pesquisa do câncer. Em particular, o desenvolvimento da tecnologia de ADN recombinante baseado em vectores para produzir pequena hairpin RNA (shRNA) dirigido pelo promotor de U6 ou H1 fez a longo prazo e gene induzível silenciamento 2,3 possível. A sua utilização em combinação com geneticamente modificadas vectores virais, tais como lentivírus, facilita altas eficiências de shRNA entrega e / ou a integração no DNA genómico de expressão shRNA estável. Nós descrevemos um pormenorizada sobred procedimento usando o DNA vector baseado em tecnologia de RNAi para determinar a função do gene, incluindo a construção de vectores que expressam lentivirais shRNA, a produção de lentivírus e infecção de células, e estudos funcionais usando um modelo de xenoenxerto de rato. Várias estratégias têm sido relatados na geração de construções de Lentivirus. O protocolo descrito aqui empregando amplificação por PCR e uma ligação de 3-fragmento pode ser usado para gerar directamente e eficientemente shRNA contendo construções de lentivirais sem deixar qualquer adjacente adicional de nucleótidos, a uma sequência de codificação shRNA. Uma vez que os cassetes de expressão shRNA criados por esta estratégia pode ser cortado por enzimas de restrição, eles podem ser facilmente transferido para outros vetores com diferentes marcadores fluorescentes ou antibiótico. Reagentes de transfecção mais comerciais podem ser utilizados na produção de lentivírus. No entanto, neste relatório, nós fornecemos um método econômico utilizando precipitação de fosfato de cálcio que pode atingir mais eficiência de transfecção de 90% emAs células 293T. Comparado com vectores de expressão constitutiva de Lentivirus, um sistema de shRNA indutível é particularmente adequado para derrubando um gene essencial para a proliferação celular. Nós demonstramos o silenciamento do gene de Yin Yang 1 (YY1), um oncogene potencial no câncer de mama 4,5, por um Tet-On sistema induzível shRNA e seus efeitos sobre a formação de tumores. A pesquisa com lentivírus requer revisão e aprovação de um protocolo de biossegurança pelo Comitê de Biossegurança da instituição de um investigador. Pesquisas usando modelos animais requer revisão e aprovação de um protocolo animal pelo Animal Care e do Comitê de Uso (ACUC) de instituição de um investigador.

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DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do gene<em&gt; In vivo</em&gt;.

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

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