Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av forskningsbidrag Scholar (116.403-RSG-09-082-01-MgO) från American Cancer Society och intramural fonder för Wake Forest University Health Sciences till GS. DBS stöddes av NCI utbildningsbidrag 5T32CA079448.

1. Generering av shRNA Konstrukt <ol><li> Identifiera en siRNA-målsekvens (20-23 nukleotider) baserat på tidigare offentliggjorda kriterier 6 eller använder en webbaserad algoritmen server, till exempel &quot;siRNA Target Finder&quot; från Ambion och GenScript. </li><li> Syntetisera oligonukleotider baserade på utformningen i figur 1 och exempel sekvenser i Tabell 1. Utföra PCR-amplifiering med användning av oligonukleotider P1 och P2 (30 cykler av denaturering vid 9...

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en metod för att slå ner en gen med användning av shRNA och visualisera dess biologiska effekt med användning av bioluminescerande avbildning av tumörcelltillväxt in vivo. Målstället av en shRNA inte bör innehålla någon av de tre restriktionsställen (BamHI, Hindlll och EcoRI) användes för subkloning. I en sällsynt scenario när någon av dessa ställen är närvarande, kan en ytterligare restriktionsenzym användas för att ersätta den i generering av konstruktionen. </...

Förutom vanlig laboratorieutrustning användes för RNA-och protein-analyser och cellodling, är följande material och reagens som krävs för detta protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td></tr><tr><td> Biosäkerhet Skåp lämplig för Biosafety Level 2 inneslutning </td></tr><tr><td> PCR-termocykler </td></tr><tr><td> Ultracentrifug </td></tr><tr><td> Anestesi-induktionskammare med isofluran asätare </td></tr><tr><td> Digital skjutmått </td></tr><tr><td> IVIS avbildningssystem </td></tr><tr><td> Mycket kompetenta DH5a E. coli </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, och Hindlll restriktionsenzymer </td></tr><tr><td> T4 DNA-ligas </td></tr><tr><td> Tredje generationens lentivirus förpackningar plasmider VSV-G, pRSV-Rev och pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Material Lista

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA-interferens (RNAi) hämmar genuttryck genom att specifikt nedbrytande mål mRNA. Sedan upptäckten av dubbelsträngat liten störning RNA (siRNA) i geners uttryck 1 har RNAi blivit ett kraftfullt forskningsverktyg i studier genfunktion. Jämfört med gen, har RNAi-medierad geners uttryck många fördelar, såsom den lätthet med vilken den genomförs och dess lämplighet för de flesta cellinjer. Flera studier har visat på tillämpningar av RNAi-teknik inom cancerforskningen. Framför allt har utvecklingen av DNA-vektor-baserad teknik för att producera små hårnål RNA (shRNA) drivs av U6 eller H1 promotor göras lång sikt och inducerbara gen tysta möjligt 2,3. Dess användning i kombination med genetiskt manipulerade virala vektorer, såsom lentivirus, underlättar höga effektiviteter av shRNA leverans och / eller integration i genomiskt DNA för stabil uttryckning shRNA. Vi beskriver ett detailed procedur med hjälp av DNA-vektor-baserad RNAi teknik för att bestämma genfunktion, inklusive konstruktion av lentivirala vektorer som uttrycker shRNA, lentivirus produktion och cell infektion och funktionella studier med en modell musen xenotransplantat. Olika strategier har rapporterats att generera shRNA konstruktioner. Det protokoll som beskrivits här använda PCR-amplifiering och en 3-fragmentet ligering kan användas för att direkt och effektivt generera shRNA-innehållande lentivirala konstruktionerna utan att lämna någon extra nukleotiden intill en shRNA kodande sekvensen. Eftersom shRNA-expressionskassetter som skapas av denna strategi kan skäras ut genom restriktionsenzymer, kan de lätt flyttas till andra vektorer med olika fluorescerande eller antibiotikum markörer. De flesta kommersiella transfektionsreagenser kan användas i lentivirus produktion. Men i denna rapport ger vi en ekonomisk metod för att använda kalciumfosfatutfällning som kan nå över 90% transfektion effektivitet i293T-celler. Jämfört med konstitutiva shRNA expressionsvektorer, är en inducerbar shRNA systemet speciellt lämpligt att taga isär en gen nödvändig för cellproliferation. Vi visar genen tysta Yin Yang 1 (YY1), en potentiell onkogen i bröstcancer 4,5, med en Tet-On inducerbara shRNA systemet och dess effekter på tumörbildning. Forskning med lentivirus kräver granskning och godkännande av ett protokoll om biosäkerhet från biosäkerhet kommittén en forskares institution. Forskning med djurmodeller kräver granskning och godkännande av ett djur protokoll från Animal Care and Use Committee (ACUC) av en forskares institution.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA-interferens (RNAi) har många fördelar jämfört med gen knockout och har i stort sett användas som ett verktyg i gen funktionella studier. Uppfinningen av DNA-vektor-baserad RNAi teknik har gjort långsiktiga och inducerbara gen knockdown möjligt och ökade också möjligheterna att geners uttryck<em&gt; In vivo</em&gt;.

DNA-vektor-baserad RNA-interferens för att studera genfunktion i Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine muskelfunktion analys

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Fastställande och spridning av mänskliga Retinoblastom Tumörer i Immune deficienta möss

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

En In Vitro Systemet studerar tumör Vilande och övergången av metastaserande tillväxt

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

En Orthotopic blåscancer modell för Gene Delivery Studier

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

Noninvasiv Intratrakeal Intubation att studera patologi och fysiologi Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensionell kulturer: Ett verktyg för att studera Normal Acinar arkitektur kontra malignt Omformning av bröstceller

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo och ex vivo Approaches att studera äggstockscancer Metastatisk Colonization av Milky Spot Structures i Peritoneal Fett

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...