Name: dna vector-based rna interference to study gene function in cancer
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

Bu çalışma Araştırmacı Amerikan Kanser Derneği Hibeler (116.403-RSG-09-082-01-MGO) ve GS Wake Forest Üniversitesi Sağlık Bilimleri intramural fonları kısmen desteklenmiştir. DBS NCI eğitim bursu 5T32CA079448 tarafından desteklenmiştir.

1. ShRNA Oluşumlar üretimi <ol><li> Daha önce yayınlanan kriterlere 6 veya Ambion ve GenScript gelen &quot;siRNA Hedef Bulucu&quot; olarak web tabanlı bir algoritma sunucu kullanmak dayalı bir siRNA hedef dizisi (20-23 nükleotid) tanımlayın. </li><li> Tablo 1, Şekil 1 ve Örnek dizilerinin tasarımına bağlı oligonükleotidler sentezlenir. Oligonükleotidler P1 ve P2 (30 at 94 denatürasyon döngüleri ° C&#39;de 30 saniye süreyle, 60 ° tavlama 30 sn için C ve 30 saniye içi...

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Bu protokol kullanılarak bir gen shRNA sökülebilen ve in vivo olarak tümör hücresi büyümesinin bioluminescent görüntüleme kullanılarak biyolojik etkisini canlandırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir shRNA hedef sitesi (BamHI, HindIII ve EcoRI) kullanılan üç sınırlandırma bölgeleri herhangi bir içermemelidir on klonlama sonrasında için. Nadir bir senaryo bu siteleri arasında herhangi bir mevcut olduğu zaman, ilave bir kısıtlama enzimiyle yapı üreten yerini almak ü...

RNA ve protein analizler ve hücre kültürü için kullanılan genel laboratuar ekipmanı ek olarak, aşağıdaki malzemeleri ve ayraçlar, bu protokolü için gereklidir. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> Biyogüvenlik Seviyesi 2 çevreleme için uygun Biyogüvenlik Kabini </td></tr><tr><td> PCR PCR </td></tr><tr><td> Ultrasantrifüjdeki </td></tr><tr><td> Izofluran temizleyiciler ile anestezi indüksiyonu odası </td></tr><tr><td> Dijital kumpas </td></tr><tr><td> IVIS görüntüleme sistemi </td></tr><tr><td> Son derece yetkin DH5a E. coli </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, ve HindIII sınırlama enzimleri </td></tr><tr><td> T4 DNA ligaz </td></tr><tr><td> Üçüncü nesil lentivirüs ambalaj plazmidler VSV-G, pRSV-Rev ve pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Malzeme Listesi

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA müdahalesi (RNAi) özellikle aşağılayıcı hedef mRNA tarafından gen ekspresyonunu inhibe. Gen suskunluğu 1 çift zincirli küçük parazit RNA (siRNA) keşfinden beri, RNAi gen fonksiyonu çalışmalarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştir. Genetik delesyon ile karşılaştırıldığında, RNAi-aracılı gen suskunluğu gibi bu gerçekleştirildiği ile kolaylıkla ve en hücre serileri için uygunluğu gibi birçok avantajı, sahiptir. Çoklu çalışmalar kanser araştırma RNAi teknolojinin uygulamaları göstermiştir. Özellikle, U6 veya H1 promotör tarafından tahrik küçük firkete RNA (shRNA) üretmek için DNA vektörü tabanlı teknolojinin geliştirilmesi mümkün 2,3 susturulmasında uzun vadeli gen ve indüklenebilir yapmıştır. Böyle lentivirüs gibi genetiği viral vektörlerin, birlikte kullanımı stabil shRNA ifade için genomik DNA&#39;ya shRNA teslimat ve / veya entegrasyon yüksek verimlilik kolaylaştırır. Bir detaile tarifd prosedürü shRNA, lentivirüs üretimi, hücre enfeksiyonu, ve bir fare xenograft modeli kullanılarak fonksiyonel çalışmalar ifade vektörlerinin lentiviral inşaat dahil geni fonksiyonu, belirlemek için DNA vektörü bazlı RNAi teknolojisi kullanılarak. Çeşitli stratejiler shRNA yapıları oluşturmak bildirilmiştir. Protokol PCR büyütmesi ve bir 3-fragmanı ligasyon kullanıldığı doğrudan ve verimli bir şekilde üretmek için kullanılabilir burada açıklanan shRNA-içeren bir shRNA kodlama sekansı için herhangi bir ek nükleotid bitişik çıkmadan lentiviral yapıları. Bu stratejinin yarattığı shRNA ifade kasetleri restriksiyon enzimleri tarafından kesilebilir olduğundan, bunlar kolaylıkla farklı floresan veya antibiyotik işaretleri ile diğer vektörlere taşınmış olabilir. En çok ticari transfeksiyon reaktifler lentivirüs üretiminde kullanılabilir. Ancak, bu raporda, biz% 90 transfeksiyon verim üzerinde elde edebilirsiniz kalsiyum fosfat kullanarak ekonomik bir yöntem sağlamak293T hücreler. Bünye shRNA ifade vektörlerinin karşılaştırıldığında, indüklenebilir shRNA sistemi hücre çoğalması için gerekli bir gen aşağı vurma özellikle uygundur. Biz Yin Yang 1 (YY1), meme kanseri 4,5 potansiyel bir onkogeninin gen susturulması göstermek, bir Tet-On indüklenebilir shRNA sistemi ve tümör oluşumu üzerindeki etkileri. Lentivirüs kullanarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Biyogüvenlik Komitesi tarafından bir biyogüvenlik protokolü onayı gerektirir. Hayvan modelleri kullanılarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından bir hayvan protokolünün onaylanması gerekiyor.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite arttı<em&gt; In vivo</em&gt;.

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

Vivo Köpek Kas Fonksiyon Testi

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

Noninvaziv Entübasyon Fare Akciğer Patolojisi ve Fizyolojisi Eğitim için

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...