Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل HL094536 (BJH).

1. عزل الميتوكوندريا من القلب ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الميتوكوندريا القلب، تخدير الفئران والتضحية وفقا للإجراءات التي وافقت عليها في منطقتك رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام. </li></ol> <stron...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

بروتوكول المعروضة هنا يصف الخطوات اللازمة لتقييم التجريبية افتتاح نفاذية المسام الانتقال في قلب معزولة الميتوكوندريا (الشكل 1 والشكل 4): إجراءات عزل الميتوكوندريا قلب الفأر، والضوابط التي تضمن سلامة الجهاز التنفسي وظيفة، المعلمات الميتوكوندريا خلال رصد mtP...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> التربسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> التربسين المانع (فول الصويا) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> الصوديوم hydrosulfite </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> روتينون </td><td> سيغما الدريخ </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> ج السيتوكروم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> السيكلوسبورين A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> FURA FF </td><td> إينفيتروجن </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; JC-1 </td><td> إينفيتروجن </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> طاحونة الأنسجة بوتر-Elvehjem مع تفلون 15 مل مدقة </td><td> ويتون للصناعات </td><td></td></tr><tr><td> النفقات العامة النمام </td><td> ويتون للصناعات </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (القطب درجة الحرارة الأكسجين للرقابة) </td><td> Hansatech الصكوك </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 مقياس التألق الطيفي الانبعاثات المزدوجة </td><td> الفوتون التكنولوجيا الدولية، وشركة </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

الانتقال نفاذية المسام الميتوكوندريا (mtPTP) هي قناة غير محددة التي تشكل غشاء الميتوكوندريا في الداخلية لنقل المواد المذابة مع الكتلة الجزيئية أصغر من 1.5 كيلو دالتون. على الرغم من أن هوية نهائية الجزيئي للمسام لا تزال قيد المناقشة، والبروتينات مثل D cyclophilin، وVDAC ANT تسهم في تشكيل mtPTP. بينما راسخة إشراك افتتاح mtPTP في موت الخلايا 1، تتراكم الأدلة تشير إلى أن mtPTP يخدم دورا الفسيولوجية خلال كا 2 + التوازن الميتوكوندريا 2، والطاقة الحيوية الأكسدة يشير 3. يتم تشغيل mtPTP الافتتاح كا 2 + مصفوفة ولكن يمكن أن يكون نشاطها عن طريق التضمين عدة عوامل أخرى مثل الإجهاد التأكسدي، ونضوب النوكليوتيدات الأدينين، تركيزات عالية من بي، الميتوكوندريا أو إزالة الاستقطاب الغشاء uncoupling، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة 4. في المختبر، mtPTP يمكن أن يكون افتتاح منظمة العمل ضد الجوعieved عن طريق زيادة تركيز الكالسيوم + 2 داخل المصفوفة الميتوكوندريا من خلال إضافات خارجية من الكالسيوم 2 + (القدرة على الاحتفاظ الكالسيوم). عندما كا 2 + المستويات داخل الميتوكوندريا التوصل إلى عتبة معينة، ويفتح mtPTP ويسهل كا 2 + الإصدار، تبديد للبروتون القوة الدافعة، وانهيار غشاء المحتملة وزيادة في حجم مصفوفة الميتوكوندريا (تورم) الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق الميتوكوندريا الغشاء الخارجي وفقدان لا رجعة فيها وظيفة العضيم. نحن هنا وصف فحص فلوروميتريك التي تسمح لتوصيف شامل لافتتاح mtPTP في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من 3 معلمات الميتوكوندريا التي يتم تعديلها عند افتتاح mtPTP يحدث: الميتوكوندريا كا التعامل مع + 2 (امتصاص وإطلاق، مقاسا كا 2 + تركيز على المدى المتوسط ​​الفحص)، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا، وmitochondrial الحجم. الأصباغ المستخدمة لقياس الكالسيوم 2 + على المدى المتوسط ​​وفحص غشاء الميتوكوندريا المحتملة هي FURA FF، وهي impermeant الغشاء، الذي يخضع لمؤشر ratiometric تحولا في الطول الموجي الإثارة في حضور كا 2 +، وJC-1، وهي الموجبة، ratiometric المؤشر الذي يشكل مونومرات الأخضر أو ​​الأحمر في المجاميع المحتملة غشاء المنخفضة والعالية، على التوالي. يتم قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء من التعليق الميتوكوندريا. منذ مطلوبة عالية الجودة، الميتوكوندريا وظيفية للمقايسة افتتاح mtPTP، وصفنا أيضا الخطوات اللازمة للحصول على حالها، إلى جانب القلب معزولة للغاية وظيفية الميتوكوندريا.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم الميتوكوندريا<sup&gt; 2 +</sup&gt; المناولة وحجم الميتوكوندريا الغشاء المحتملة والميتوكوندريا. وكما وصفت إجراءات الحصول على قلب عالية الجودة والوظيفية الميتوكوندريا.

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

إعداد قلب فأر اقترن الارتحال الميتوكوندريا

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

طرق تقدير من معدلات الجلوكوز والأحماض الدهنية الأكسدة في عزل قلب الجرذ العمل

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

الماوس معزولة تقنية الكلى Perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: نقل معزولة الإنسان MSC الميتوكوندريا إلى خلايا الجذعية ورم أرومي دبقي

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...