Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door HL094536 (BJH).

1. Isolatie van mitochondriën van Mouse Hart <ol><li> Te isoleren hart mitochondriën, verdoven en te offeren muizen volgens de procedures die zijn goedgekeurd door uw lokale Institutionele Animal Care en gebruik Comite. </li></ol> Opmerking: Alle stappen van de mitochondria isolatie-protocol moet worden uitgevoerd op ijs. Gebruik ijskoude buffers en voorgekoeld Petrischalen, Falcon buizen en Eppendorf buizen. De volumes die in het protocol zijn voor een monster dat 2 muis...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

De hier gepresenteerde protocol beschrijft de benodigde experimentele stappen permeabiliteit transitie porie opening beoordelen geïsoleerde hart mitochondria (figuur 1 en figuur 4): de werkwijze voor het isoleren muizenhart mitochondria, de luchtwegen controles die de integriteit en functionaliteit, de mitochondriale parameters gecontroleerd tijdens mtPTP opening en de kleurstoffen gebruikt voor de meting, het opzetten van de spectrofluorimetrische instrumentatie, en de karakterisering...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Trypsineremmer (soja) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Natriumhydrosulfiet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytochroom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue grinder Potter-Elvehjem met Teflon stamper 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Overhead roerder </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperatuurgestuurde zuurstofelektrode) </td><td> Hansatech Instrumenten </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 dual-emissie spectrofluorometer </td><td> Photon Technology International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

De mitochondriale permeabiliteit transitie poriën (mtPTP) is een niet specifiek kanaal vormt in het binnenste mitochondriale membraan opgeloste stoffen transport met een moleculaire massa kleiner dan 1,5 kDa. Hoewel de definitieve moleculaire identiteit van de porie nog steeds ter discussie, eiwitten zoals cyclofiline D, VDAC en ANT bijdragen aan de vorming mtPTP. Hoewel de betrokkenheid van mtPTP opening in celdood is goed ingeburgerd 1, accumuleren gegevens blijkt dat het mtPTP een fysiologische rol dient tijdens mitochondriale Ca2 + homeostase 2, bio-energetica en redox signalering 3. mtPTP opening wordt geactiveerd door matrix Ca 2 +, maar de activiteit kan gemoduleerd worden door verschillende factoren zoals oxidatieve stress, adenine nucleotide uitputting hoge concentraties Pi, mitochondriale membraan depolarisatie of ontkoppelen en lange vetzuurketens 4. In vitro, mtPTP opening kan achieved door meer Ca2 + concentratie in de mitochondriale matrix door exogene toevoeging van Ca 2 + (calcium retentievermogen). Wanneer Ca 2 + niveaus binnen mitochondria bereiken van een bepaalde drempel, de mtPTP opent en faciliteert Ca 2 + release, dissipatie van het proton beweging veroorzakende kracht, membraanpotentiaal ineenstorting en een toename van de mitochondriale matrix volume (zwelling), die uiteindelijk leidt tot de breuk van de buitenste mitochondriale membraan en onomkeerbaar verlies van organellen functie. Hier beschrijven we een fluorometrische assay waarmee een uitgebreide karakterisering van mtPTP opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van drie mitochondriale parameters die gewijzigd wanneer mtPTP opening plaatsvindt: mitochondrial Ca 2 + handling (opname en afgifte, zoals gemeten door Ca2 + concentratie in het testmedium), mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondrial volume. De kleurstoffen toegepast voor Ca 2 + meting in het testmedium en mitochondriale membraanpotentiaal zijn Fura FF, een membraan impermeant, ratiometrisch indicator die een verschuiving in de golflengte in aanwezigheid van Ca 2 +, en JC-1, een kationische ondergaat, ratiometrische indicator die groen of rood monomeren aggregaten vormt bij lage en hoge membraanpotentiaal respectievelijk. Veranderingen in de mitochondriale volume worden gemeten door lichtverstrooiing door de mitochondriale schorsing. Sinds hoogwaardige, functionele mitochondriën nodig zijn voor de mtPTP opening test, hebben we ook een beschrijving van de stappen die nodig zijn voor het verkrijgen intact, zeer gekoppeld en functionele geïsoleerde hart mitochondriën.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca mitochondria<sup&gt; 2 +</sup&gt; Handling, mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondriale volume. De procedure voor het verkrijgen van hoge kwaliteit en functionele hart mitochondria wordt ook beschreven.

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P<sub&gt; F</sub&gt;) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: overbrengen geïsoleerde menselijke MSC Mitochondriën aan glioblastoma Stamcellen

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...