Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי HL094536 (BJH).

1. בידוד של המיטוכונדריה מלב מאוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד לב מיטוכונדריה, להרדים ולהקריב עכברים בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים המקומי וועדת שימוש. </li></ol> הערה: כ?...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

הפרוטוקול המובא כאן מתאר את הצעדים הניסיוניים הדרושים כדי להעריך פתיחה נקבובית מעבר חדירות בלב מיטוכונדריה מבודד (איור 1 ואיור 4): ההליך לבידוד לב העכבר מיטוכונדריה, פקדי נשימה המבטיחים יושרה והפונקציונלית שלהם, פרמטרים המיטוכונדרי במעקב במהלך פתיחת mtPTP ואת...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> טריפסין המעכב (סויה) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> hydrosulfite נתרן </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> ציטוכרום C </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> ציקלוספורין </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> מטחנת רקמה פוטר-Elvehjem עם טפלון העלי 15 מ&quot;ל </td><td> תעשיות ויטון </td><td></td></tr><tr><td> stirrer העילי </td><td> תעשיות ויטון </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (אלקטרודה חמצן הטמפרטורה המבוקרת) </td><td> Hansatech מכשירים </td><td></td></tr><tr><td> spectrofluorometer הפליטה QuantaMaster 80 כפול </td><td> פוטון טכנולוגית International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

נקבובי מעבר חדירות המיטוכונדריה (mtPTP) הוא ערוץ מסוים שאינם נוצר בקרום המיטוכונדריה הפנימי להובלה מומסת עם מסה מולקולרית קטנה מ -1.5 kDa. למרות הזהות המוחלטת המולקולרית של נקבובי היא עדיין תחת דיון, חלבונים כגון cyclophilin D, VDAC וANT לתרום להיווצרות mtPTP. למרות המעורבות של פתיחת mtPTP במוות של תאים מבוססת היטב 1, מצטבר ראיות מצביע על כך שmtPTP משרת תפקיד פיסיולוגי במהלך המיטוכונדריה Ca 2 + הומאוסטזיס 2, bioenergetics וחמזור איתות 3. פתיחת mtPTP מופעלת על ידי מטריקס Ca 2 + אבל פעילותו יכולה להיות מווסתת על ידי מספר גורמים אחרים כגון סטרס חמצונים, דלדול נוקלאוטיד אדנין, ריכוזים גבוהים של פי, שלילת קוטביות הקרום המיטוכונדריה או תרה, וחומצות שומן ארוכת שרשרת 4. במבחנה, mtPTP פתיחה יכולה להיות achieved על ידי הגדלת ריכוז + Ca 2 בתוך מטריצת המיטוכונדריה באמצעות תוספת חיצונית של Ca 2 + (קיבולת אצירת סידן). כאשר Ca 2 + רמות בתוך המיטוכונדריה מגיע לסף מסוים, ומאפשר mtPTP פותח Ca 2 + שחרור, פיזורו של כוח מניע הפרוטונים, קריסת פוטנציאל קרום וגידול בהיקף מטריקס המיטוכונדריה (נפיחות) שסופו של דבר מוביל לקרע של קרום חיצוני של המיטוכונדריה ואובדן בלתי הפיך של תפקוד אברון. כאן אנו מתארים assay fluorometric המאפשר אפיון מקיף של פתיחת mtPTP בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של 3 פרמטרי המיטוכונדריה ששינו כאשר פתיחת mtPTP מתרחשת: המיטוכונדריה Ca 2 + הטיפול (ספיגה ושחרורו, כפי שהיא נמדדת על ידי Ca 2 + ריכוז במדיום assay) פוטנציאלית, מיטוכונדריה ממברנה, וmitochoנפח ndrial. את הצבעים המועסקים על Ca 2 + מדידה במדיום assay ופוטנציאל הקרום המיטוכונדריה הם Fura FF, impermeant קרום, מחוון ratiometric שעובר שינוי באורך גל העירור בנוכחות Ca 2 +, וJC-1, קטיוני, מחוון ratiometric המהווה מונומרים ירוקים או אדומים אגרגטים בפוטנציאל קרום נמוך וגבוה, בהתאמה. שינויים בהיקף המיטוכונדריה נמדדים על ידי הקלטת פיזור אור על ידי ההשעיה של המיטוכונדריה. מאז באיכות גבוהה, המיטוכונדריה פונקציונלית נדרשות לבדיקת פתיחת mtPTP, אנחנו גם מתארים את הצעדים הדרושים כדי להשיג לב שלם, בשילוב ומאוד פונקציונלי מבודד המיטוכונדריה.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca מיטוכונדריה<sup&gt; 2 +</sup&gt; טיפול, קרום נפח פוטנציאלי ומיטוכונדריה המיטוכונדריה. ההליך לקבלת לב איכותי ופונקציונלי המיטוכונדריה הוא גם תאר.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: העברת המיטוכונדריה MSC אדם מבודד בתאי גזע Glioblastoma

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...