Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
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1。マウスの心臓からミトコンドリアの単離<ol><li>心臓がミトコンドリア単離するためには、あなたの地元の施設内動物のケアと使用委員会によって承認された手順に従って、マウスを麻酔し、生け贄に捧げる。 </li></ol> 注：ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、氷上で行う必要があります。氷冷緩衝液及び予冷ペトリ皿、ファルコンチュ?...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

ここで紹介するプロトコルはミトコンドリア単離心臓（ 図1および図4）に透過性遷移孔の開口部を評価するために必要な実験手順を説明します。マウス心臓ミトコンドリアを単離するための手順を、それらの整合性と機能性を確保呼吸のコントロールは、ミトコンドリアのパラメータが中に監視mtPTP開口部とその測定に用いる染料、蛍光分光計測器のセットアップ、?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T3030 </td></tr><tr><td>トリプシンインヒビター（大豆） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9128 </td></tr><tr><td>ヒドロ亜硫酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 71699 </td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R8875 </td></tr><tr><td> シトクロム c </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7752 </td></tr><tr><td>アラメチシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C2759 </td></tr><tr><td>シクロスポリン</td><td>カルビオケム</td><td> 239835 </td></tr><tr><td>フラFF </td><td>インビトロジェン</td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; JC-1 </td><td>インビトロジェン</td><td> T3168 </td></tr><tr><td>テフロン乳棒15mlで組織グラインダーポッターエルベージェム</td><td>ウィートンインダストリーズ</td><td></td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー</td><td>ウィートンインダストリーズ</td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm（温度制御された酸素極） </td><td> Hansatechインスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80デュアルエミッション蛍光分光光度計</td><td>フォトンテクノロジーインターナショナル、Inc。 </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

ミトコンドリア透過性遷移孔（mtPTP）が1.5 kDaのより小さい分子量を有する溶質を輸送するためにミトコンドリア内膜で形成し、非特定のチャンネルです。細孔の決定的な分子的同一性が議論中であるが、そのようなシクロフィリンD、VDACとANTのようなタンパク質は、形成をmtPTPに貢献します。細胞死におけるmtPTP開口部の関 ​​与は十分に1を確立されている間、累積証拠はmtPTPは、ミトコンドリアのCa 2 +恒常性2、バイオエナジェティックスと3シグナル伝達レドックス中に生理的な役割を果たしていることを示しています。 mtPTP開口部はマトリックスのCa 2 +が、その活性は、酸化ストレスなどのいくつかの他の要因によって変調することができ、アデニンヌクレオチド枯渇、Piの高濃度、ミトコンドリア膜の脱分極や脱共役、および長鎖脂肪酸酸4。 インビトロ 、mtPTPによってトリガされる開口部は、ACHすることができますCa 2 +の外因性の追加（カルシウム保持能力）を介してミトコンドリアのマトリックス内のCa 2 +濃度を増加させることによりieved。 のCa 2 +レベルのミトコンドリア内部の特定のしきい値に達したときに、mtPTPが開き、のCa 2 +放出を容易にする 、プロトン駆動力の損失、膜電位が崩壊し、最終的に破裂につながるミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）の増加ミトコンドリア外膜およびオルガネラ機能の不可逆的な損失。 ここでは、単離ミトコンドリアマウス心臓におけるmtPTP開口部の総合的な特性評価を可能にする蛍光分析について説明します。ミトコンドリアのCa 2 +ハンドリング（取り込みと放出は、Ca 2によって測定されたアッセイ培地中+濃度）、ミトコンドリア膜電位、及びmitocho：アッセイはmtPTP開口部が発生したときに変更されている3つのミトコンドリアのパラメータの同時測定を含むndrialボリューム。アッセイ培地とミトコンドリア膜電位のCa 2 +測定を採用染料はフラFF、膜透過性は、Ca 2 +の存在下で励起波長のシフトを受けるレシオメトリックインジケータ、JC-1は、カチオン性であり、それぞれ、低域と高膜電位でグリーンモノマー又は赤凝集体を形成レシオメトリックインジケータ。ミトコンドリアの体積の変化はミトコンドリア懸濁液による光散乱を記録することによって測定されます。高品質で機能的なミトコンドリアがmtPTP開アッセイに必要とされるため、我々はまた、無傷ミトコンドリア、高度に結合されており、機能的な孤立した心を得るために必要な手順について説明します。

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む<sup&gt; 2 +</sup&gt;ハンドリング、ミトコンドリア膜電位およびミトコンドリアボリューム。ミトコンドリアは、高品質で機能的な心臓を取得するための手順も記載されている。

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

ミトコンドリアは密結合のラットの心臓の準備

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング<em&gt;インビボ</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

マウス単離された灌流腎臓テクニック

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...