Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av HL094536 (BJH).

1. Isolasjon av Mitokondrier fra Mouse Hjerte <ol><li> Å isolere hjerte mitokondrier, bedøve og ofre mus i henhold til prosedyrer godkjent av den lokale Institutional Animal Care og bruk komité. </li></ol> Merk: Alle trinnene i mitokondriene isolasjon protokollen må utføres på is. Bruk iskalde buffere og pre-kjølt petriskåler, Falcon rør og Eppendorf rør. Volumene gitt i protokollen er for en prøve inneholdende 2 mus hjerter. <ol start="2"><li> Fjern hje...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

Protokollen som presenteres her beskriver de nødvendige eksperimentelle skritt for å vurdere permeabilitet overgang pore åpningen i isolerte hjerte mitokondrier (Figur 1 og Figur 4): prosedyren for å isolere mus hjerte mitokondriene, respiratoriske kontroll som sikrer deres integritet og funksjonalitet, mitokondrie parametre overvåkes under mtPTP åpning og fargestoffer som benyttes for måling deres, opprettelsen av den spectrofluorometric instrumentering, og karakterisering av mt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Trypsin inhibitor (soyabønner) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Natriumhydrosulfitt </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytokrom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Ciklosporin A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue jeksel Potter-Elvehjem med Teflon pistill 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Røremotorer </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperatur kontrollert oksygenelektrode) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 dual utslipp spektrofluorometer </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mtPTP) er en ikke spesifikk kanal som dannes i den indre mitokondrielle membranen å transportere oppløste stoffer med en molekylvekt mindre enn 1,5 kDa. Selv om definitive molekylære identiteten til pore er fortsatt under debatt, proteiner som cyclophilin D, VDAC og ANT bidra til mtPTP formasjon. Mens involvering av mtPTP åpning i celledød er godt etablert 1., samler bevis indikerer at mtPTP serverer en fysiologisk rolle under mitokondrie Ca 2 + homeostasis 2, bioenergi og redoks signalering 3. mtPTP åpning er utløst av matrix Ca 2 +, men sin aktivitet kan moduleres av flere andre faktorer som oxidative stress, adenin nukleotid utarming, høye konsentrasjoner av Pi, mitokondrie membran depolarisering eller frakobling, og langkjedede fettsyrer 4. In vitro mtPTP åpning kan være achieved ved å øke Ca 2 + konsentrasjon inne i mitokondriematrix gjennom eksogene tilsetninger av Ca 2 + (kalsium oppbevaring kapasitet). Når Ca 2 + nivåer innenfor mitokondrier når en viss terskel, åpnes mtPTP og legger til rette Ca 2 + utgivelse, spredning av proton drivkraften, membranpotensiale kollaps og en økning i mitokondriematrix volum (hevelse) som til slutt fører til brudd på ytre mitokondriemembranen og irreversibelt tap av organeller funksjon. Her beskriver vi en fluorometrisk analyse som gjør det mulig for en omfattende karakterisering av mtPTP åpning i isolerte mus hjerte mitokondrier. Analysen involverer samtidig måling av 3 mitokondrie parametere som endres når mtPTP åpning oppstår: mitokondrie Ca 2 + håndtering (opptak og utslipp, målt ved Ca 2 + konsentrasjon i analysemedium), mitokondriell membranpotensiale og mitochondrial volum. Fargestoffene anvendt for Ca 2 + måling i analysemedium og mitokondrielle membranpotensiale er Fura FF, en membran impermeant, Proporsjonal indikator som gjennomgår en endring i eksitasjonsbølgelengde i nærvær av Ca 2 +, og JC-1, en ​​kationisk, Proporsjonal indikator som danner grønne monomerer eller røde aggregater ved lav og høy membranpotensiale, henholdsvis. Endringer i mitokondrie volum måles ved å registrere lysspredning ved mitokondrie suspensjonen. Siden høy kvalitet, funksjonelle mitokondrier er nødvendig for mtPTP åpningen analysen, har vi også beskrive de nødvendige skritt for å få intakt, svært kombinert og funksjonelle isolert hjerte mitokondrier.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

En spectrofluorometric protokoll for måling av mitokondrie permeabilitet overgangen pore åpningen i isolerte mus hjerte mitokondrier er presentert her. Analysen involverer samtidig måling av mitokondrier Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Håndtering, mitokondrie membran potensial og mitokondrie volum. Fremgangsmåten for å oppnå høy kvalitet og funksjonell hjerte mitokondriene er også beskrevet.

Multi-parameter Måling av permeabilitet Transition pore åpningen i Isolert Mouse Hjerte Mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging av enkelt Mitokondrielle superoksid Blinker Intakt hjerte eller<em&gt; I Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodeteksjonsprosedyren av yttermembran Proteiner med flowcytometri av Isolated Mitokondrier

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling av Smooth muskelfunksjon i de Isolert Tissue Bath-applikasjoner til Farmakologi Forskning

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Micro respirasjonsmålinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Metoder for bestemmelse av priser av glukose og fettsyreoksidasjon i isolerte Working Rat Hjerte

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Musen isolerte perfuserte Nyre Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: Overføre isolert human MSC Mitokondrier å glioblastom stamceller

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...