Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Эта работа была поддержана HL094536 (BJH).

1. Выделение митохондрий из сердца мышей <ol><li> Для выделения митохондрий сердца, обезболить и пожертвовать мышей в соответствии с процедурами, утвержденными локальной Институциональные уходу и использованию животных комитета. </li></ol> Примечание: Все шаги митох?...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

Протокол, представленные здесь описываются необходимые экспериментальные шаги для оценки проницаемости переход пор открытие в изолированных митохондриях сердца (рис. 1 и 4): процедура выделения мышью митохондрий сердца, дыхательной управления, обеспечения их целост...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td></tr><tr><td> Трипсин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Ингибитора трипсина (соя) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Натрия гидросульфит </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Ротенон </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Цитохром с </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Аламетицин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Циклоспорин </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Фура FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Ткань мясорубку Поттер Elvehjem с тефлоновым пестиком 15 мл </td><td> Уитон Industries </td><td></td></tr><tr><td> Накладные мешалкой </td><td> Уитон Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (с контролем температуры кислородного электрода) </td><td> Hansatech инструменты </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 двойных спектрофлуориметре выбросов </td><td> Фотон Technology International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Митохондриальной поры перехода проницаемости (mtPTP) является не определенный канал, который образует на внутренней митохондриальной мембраны для транспортировки растворенных веществ с молекулярной массой менее 1,5 кДа. Хотя окончательное молекулярно личности пор находится в стадии обсуждения, белки, такие как циклофилин D, VDAC и ANT вклад в формирование mtPTP. Хотя участие в открытии mtPTP гибели клеток хорошо известно 1, накапливаются данные свидетельствуют о том, что mtPTP служит физиологическая роль в митохондриальной Ca 2 + гомеостаза 2, биоэнергетика и окислительно-восстановительные сигнализации 3. mtPTP открытие вызвано матрицы Ca 2 +, но его активность может быть модулированным ряда других факторов, таких как окислительный стресс, аденин нуклеотидных истощение, высокая концентрация Pi, митохондриальной деполяризации мембраны или разобщение, и длинные цепочки жирных кислот 4. в пробирке, mtPTP Открытие может быть ACHieved за счет увеличения концентрации Са 2 + в митохондриях путем добавления экзогенного Ca 2 + (мощность удержания кальция). Когда Ca 2 + уровней внутри митохондрий достигает определенного порога, mtPTP открывает и облегчает Са 2 +, диссипация движущей силой протонов, мембранный потенциал коллапса и увеличение объема митохондриальной матрицы (отек), что в конечном итоге приводит к разрыву внешней митохондриальной мембраны и необратимой потере функции органелл. Здесь мы опишем флуорометрической анализа, который позволяет всеобъемлющей характеристикой mtPTP открытия в изолированном сердце мыши митохондрий. Анализ включает в себя одновременное измерение от 3 ​​митохондриальных параметров, которые изменяются при открытии mtPTP происходит: митохондриальная Ca 2 + обработка (поглощение и освобождение, измеряемые концентрации Са 2 + в тесте среды), митохондриальный мембранный потенциал, и mitochondrial объеме. Красители, используемые для Ca 2 + измерение в среде анализа и митохондриального мембранного потенциала являются Fura FF, мембранные impermeant, логометрические индикатор, который претерпевает сдвиг длины волны возбуждения в присутствии Ca 2 + и JC-1, катионные, логометрические индикатор, который образует зеленую или красную мономеров агрегатов при низких и высоких мембранного потенциала, соответственно. Изменения в митохондриальной объем измеряется путем регистрации рассеяния света митохондриальной суспензии. С высоким качеством, функциональными митохондрий, необходимых для анализа открытии mtPTP, мы также описываются шаги, необходимые для получения нетронутыми, очень связаны и функциональные изолированного сердца митохондрий.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Spectrofluorometric протокол для измерения проницаемости митохондриальной переход пор отверстие в изолированном сердце мыши митохондрий, представленные здесь. Анализ включает в себя одновременное измерение митохондрий Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Обработка, мембраны митохондрий и митохондриальной потенциальных объемов. Процедура получения качественных и функциональных митохондрий сердца также описан.

Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Подготовке высококвалифицированных Связанные сердце крысы Митохондрии

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или<em&gt; В Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Количественная Single микрососудов проницаемость в изолированном крови-перфузии Rat Подготовка легких

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Иммунологический из белков наружной мембраны с помощью проточной цитометрии из изолированных митохондрий

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Измерение гладких мышцах функции в выделенную ткань баня приложений к фармакологии исследований

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Методы определения ставок глюкозы и жирных кислот Окисление в изолированной рабочей сердца крысы

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Мышь Изолированные перфузировались почки Техника

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: Передача Изолированные Человеческий MSC митохондрии глиобластомы стволовых клеток

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...