Name: multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Detta arbete stöddes av HL094536 (BJH).

1. Isolering av mitokondrier från mushjärta <ol><li> För att isolera hjärta mitokondrier, söva och offra möss enligt de förfaranden som godkänts av den lokala institutionella Animal Care och användning kommittén. </li></ol> Obs: Alla steg i mitokondrierna isolering protokollet måste utföras på is. Använd iskalla buffertar och pre-kylda petriskålar, Falcon rör och Eppendorf rör. De volymer som anges i protokollet är för ett prov som innehåller 2 mus hjär...

<ol>
	<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death.">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2++exchange,+metabolic+flexibility,+and+propensity+for+heart+failure+in+mice.">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li><li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

Protokollet presenteras här beskriver de nödvändiga experimentella åtgärder för att bedöma permeabilitet öppning övergång por i isolerat hjärta mitokondrier (figur 1 och figur 4): förfarandet för att isolera mus hjärta mitokondrier, de respiratoriska kontroller som säkerställer deras integritet och funktionalitet de mitokondriella parametrar övervakas under mtPTP öppning och färgämnena som används för deras mätning, inrättandet av den spektrofluorometrisk instrum...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Trypsininhibitor (sojaböna) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Natriumhydrosulfit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71.699 </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytokrom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyklosporin A </td><td> Calbiochem </td><td> 239.835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue grinder Potter-Elvehjem med Teflon mortel 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Överliggande omrörare </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903.475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperaturkontrollerad syreelektrod) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 dubbel utsläpp spektrofluorometer </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Den mitokondriella permeabilitet övergång porer (mtPTP) är en icke specifik kanal som bildas i det inre mitokondriemembranet att transportera lösta ämnen med en molekylvikt mindre än 1,5 kDa. Även om den definitiva molekylära identitet por är fortfarande under debatt, proteiner såsom cyklofilin D VDAC och ANT bidrar till mtPTP bildas. Även medverkan mtPTP öppning i celldöd är väl etablerad 1, ackumulerande bevis tyder på att mtPTP serverar en fysiologisk roll under mitokondriell Ca 2 + homeostas 2, bioenergetik och redox signalering 3. mtPTP öppning utlöses av matris Ca 2 +, men dess aktivitet kan moduleras av flera andra faktorer såsom oxidativ stress, adeninnukleotid utarmning, höga koncentrationer av Pi, mitokondrie membrandepolarisering eller påhängsvagn, och långkedjiga fettsyror 4. In vitro mtPTP öppning kan ACHieved genom att öka Ca 2 + koncentrationen inuti den mitokondriella matrisen genom exogena tillsatser av Ca 2 + (kalcium retentionskapacitet). När Ca 2 + nivåer inuti mitokondrier når en viss tröskel, öppnas mtPTP och underlättar Ca 2 + frisättning, avledning av protonen drivkraft, membranpotentialen kollaps och en ökning av mitokondriella matrisen volym (svullnad) som slutligen leder till bristning av yttre mitokondriemembranet och oåterkallelig förlust av organell funktion. Här beskriver vi en fluorometrisk analys som möjliggör en omfattande karakterisering av mtPTP öppning i isolerad mushjärta mitokondrier. Analysen innefattar samtidig mätning av 3 mitokondriella parametrar som förändras när mtPTP öppning inträffar: mitokondriell Ca 2 + hantering (upptag och frisättning, såsom mätt genom Ca 2 +-koncentrationen i analysmedium), mitokondriell membranpotential, och mitochondrial volym. De färgämnen som används för Ca 2 + mätning i analysmediet och mitokondriell membranpotential är Fura FF, ett membran ogenomträngligt, kvotmetrisk indikator som genomgår en förändring i excitationsvåglängd i närvaro av Ca 2 +, och JC-1, en ​​katjonisk, ratiometrisk indikator som bildar gröna monomerer eller röda aggregat vid låg och hög membranpotential, respektive. Förändringar i mitokondriernas volym mäts genom att registrera ljusspridning av det mitokondriella fjädring. Eftersom hög kvalitet, funktionell mitokondrier krävs för mtPTP öppna analysen beskriver vi också de åtgärder som krävs för att få intakt, mycket kopplat och funktionell isolerad hjärta mitokondrier.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria at JoVE.com

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Ett spektrofluorometrisk protokoll för mätning av mitokondriell permeabilitet övergången pore öppning i isolerad mus hjärta mitokondrier presenteras här. Analysen involverar samtidig mätning av mitokondrier Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Hantering, mitokondriell membranpotential och mitokondriell volym. Förfarandet för att erhålla hög kvalitet och funktionella hjärta mitokondrier beskrivs också.

Flera parametrar Mätning av permeabiliteten Transition poröppning i isolerade mus hjärta mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Beredning av Mycket Tillsammans Rat hjärta mitokondrier

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal avbildning av Single Mitochondrial Superoxid Blinkar i intakt hjärta eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifiera Single microvessel permeabilitet i Isolerad Blod-perfusion Rat Lung Förberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Mätning av det osmotiska Vatten permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av Sfäriska Celler: isolerade växtprotoplaster som exempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodetektering av yttermembranproteiner med flödescytometri av isolerat Mitokondrier

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mätning av Smooth muskelfunktion i isolerad vävnad Bath-ansökningar till farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Microandnings Mätningar

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Metoder för bestämning av priser av glukos och fettsyra oxidation i isolerade Working Rat hjärta

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Musen Isolerad perfusion njure Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

MitoCeption: Överföra isolerat humant MSC Mitokondrier till Glioblastoma stamceller

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...