Name: generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af NEURON-Eranet opdage (BMBF 01EW1003) til CK og JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CKVB understøttes af en tildeling af Forschungskommission af det medicinske fakultet ved universitetet i Düsseldorf.

1. Fremstilling af Aggresome donorceller: Transfektion af Monomer Red Fluorescent Protein (mRFP) eller Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)-tagged human fuld længde (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1,5 x 10 6/10 cm parabol human neuroblastom NLF (NLF, Børnenes Hospital i Philadelphia, Philadelphia, PA) celler i ti 10 cm skåle og vokse natten over. NLF celler dyrkes i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS, penicillin / Strepomycin, L-glutamin. Den næste dag, skal cellerne være på 70-80% konfluens. </li><li> Forbigående transficere hver 10 cm skål med 15 ug plasmid-DNA og Metafectene transfektionsreagens (Biontex, Martinsried, Tyskland). Kort sagt, for en 10 cm skål blev 15 ug plasmid-DNA og 30 pi Metafectene tilsat til 750 pi Opti-MEM, blandet og inkuberet ved stuetemperatur i 20 min. 5 retter blev transficeret med pcDNA3.1 mRFP / eGFP-mærkede humane (FL) DISC1 og 5 retter med EGFP-plasmidet alene. </li></ol> 2. AggresomeOprensning fra transficerede donorceller Protokollen beskrevet her er en kombination af en metode til at rense Lewy-organer fra hjernevæv 13 og en protokol til at isolere store aggregater og aggresomes 14. Da allerede eksisterende metoder er baseret på brugen af ​​detergenter, isolering af detergent-free protein til anvendelse i celle-invasionsevne assays er kritisk. <ol><li> 48 timer efter transfektion overvåge ekspression af eGFP og mRFP/eGFP-DISC1 og bekræfte dannelsen af aggresomes under et fluorescensmikroskop (fig. 1). </li><li> Vask cellerne med PBS pH 7,4, skrab med 400 pi PBS hver, tilsættes 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) og sprænge cellerne under anvendelse af en Precellys24 homogenisator (Bertin Technologies, France). Kort beskrevet tilsættes 1 ml cellesuspension til en 2 ml lysis rør og tilføje 10 keramiske kugler. Lysere cellerne med 3 x 60 sek pulser. Den mekaniske kraft af processen kanforøge temperaturen i prøven over 37 ° C, så skal sørges til nedkøling af prøven på is efter lyseprocedure. </li><li> Afkøle cellerne på is, og der tilsættes 10 mM MgCI2, 40 U / ml DNase A og inkuberes i 60 minutter ved 37 ° C </li><li> Fremstille opløsninger af 80%, 50%, 20% saccharose (vægt / volumen) i PBS pH 7,4 (10 ml hver). </li><li> Forberede saccharosegradient i et 15 ml Falcon-rør, begyndende med 2 ml 80% saccharose, efterfulgt af 50% og 20%. Hæld gradient langsomt og være omhyggelig med ikke at forstyrre allerede hældt lag. Lag det fordøjede lysat på toppen af ​​gradienten og centrifuger i 15 minutter ved 1000 x g ved 4 ° C. </li><li> Omhyggeligt indsamle interfasen mellem 50-80% saccharose lag med en pipette og blandes med 5 volumener PBS, pH 7,4. Centrifuger i 15 minutter ved 1000 x g ved 4 ° C. Gentag vask to gange mere. I denne interfase, er aggresomes fluorescerende og kan visualiseres i et mikroskop under UV-lys. </li><li> Supernatanten fjernes, ogpellet resuspenderes i 250-500 pi PBS pH 7,4. Denne pellet indeholder det oprensede aggresomes (figur 2). </li></ol> 3. Behandling af Recipient SH-SY5Y Celler med mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Seed 5 x 10 4 Modtager SH-SY5Y humane neuroblastomceller konstitutivt udtrykker GFP-DISC1 (598-854) på sterile dækglas i hver brønd i en plade med 24 brønde. SH-SY5Y celle dyrkes i DMEM/F-12 medium suppleret med penicillin / streptomycin, ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) og 10% FBS. </li><li> 24 timer senere tilsættes 10 gl til hver brønd og inkuberes i 48-72 timer. </li><li> Vask cellerne 3 x med PBS pH 7,4 og slukke ekstracellulære fluorescens med 0,04% trypanblåt i 5 minutter. </li><li> Fikseres cellerne med 4% PFA i PBS pH 7,4 i 10 minutter på is, vaskes en gang med sterilt H2O og montere dækglassene på objektglas med forlænge guld med DAPI Mounting Medium (Invitrogen, USA). </li><li> Bekræft optagelsen /invasion af eksogent anvendte aggresomes ved colokalisering med rekrutterede proteiner udtrykt ved recipientceller i Z-stack billeder. </li></ol> Alligevel kan optagelse / invasion af exogent protein ikke væsentligt påvises parallelt med rekruttering af værtscelleprotein. I vores eksempel mRFP-mærket DISC1 aggresomes rekrut opløseligt GFP-mærket DISC1 (598-854) protein udtrykt af værtscellen (se figur 3). Billeder blev taget på et Zeiss LSM 510 konfokal-eller en Zeiss AxioVision Apotome2 Microscope. 4. Fremstilling af rekombinant DISC1 (598-785) I en tidligere publikation analyserede vi evnen hos forskellige DISC1 proteinfragmenter til selv interagerer baseret på tilstedeværelsen af ​​selvassociering domæner. Blandt alle proteinfragmenter testede humane DISC1 (598-785) viste den stærkeste multimerisering tilbøjelighed 4 (figur 4). Derfor blev human DISC1 (598-785) klonet ind i pET15b (nr.vagen, Madison, Wisconsin) indeholdende et N-terminalt 6-histidin-tag, udtrykt i E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), og oprenset under denaturerende betingelser på 8 mol / l urinstof som beskrevet 4. Kort sagt er protokollen beskrevet nedenfor. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli blev dyrket i 2 x 500 ml 2YT indeholdende 5 mM-arginin-HCI, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chloramphenicol op til en OD600: 0,6-0,8 og DISC1 (598-785) ekspression blev induceret med 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) blev udtrykt i 4 timer ved 37 ° C, blev ekspressionen afsluttet ved at høste bakterierne ved centrifugering. </li><li> Den bakterielle pellet blev resuspenderet i 50 ml TE-buffer (50 mM TRIS-HCI pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 og 400 U/50 ml DNase I. For at sikre fuldstændig lyse blev reaktionen inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. </li><li> Tilsættes 10 mM β-mercaptoethanol (ME) og 500 mM NaCl og inkuberes i yderligere 30 minutter. </li><li> Spin ned bakterielle inklusionslegemer ved 20.000 g i 30 min ved 4 ° C. </li><li> Resuspender pellet i 50 ml ekstraktionsbuffer indeholdende 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCI, 8 M urea og 10 mM β-ME og fjerne nedbrudt materiale ved centrifugering ved 20,000 g i 30 min ved 4 ° C. </li><li> Vask Ni-NTA agarose matrix med ekstraktionsbuffer. Inkubér resuspenderede, klaret proteinekstrakt med Ni-NTA-matrix i 2 timer ved stuetemperatur. </li><li> Vask Ni-NTA-matrix med ekstraktionsbuffer indeholdende 12 mM imidazol. </li><li> Eluere proteinet langsomt med 15 ml elueringspuffer indeholdende 50 mM Tris, 500 mM NaCI, 300 mM imidazol, 8 M urinstof, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA og 10 mM β-ME. </li><li> Dialyseres proteinet trinvist til PBS pH 7,4 indeholdende 10 mM β-ME. </li></ol> Fra 1 L bakteriel starter kultur er det muligt at isolere op til 50 mg rekombinant DISC1 (598-785) protein. α-synuclein refoldning For eksperimenter med α-synuclein, 500 ug af det rekombinante protein (Sigma-Aldrich, USA) blev opløst i PBS ved en koncentration på 1 mg / ml. Til opnåelse af oligomerer, blev genfoldning udført natten over ved 37 ° C som beskrevet i en tidligere publikation 10. 5. Mærkning af rekombinant DISC1 (598-785) med DyLight594 <ol><li> Før den efterfølgende etiketteringsprocessen, DISC1 (598-785) protein har blive befriet for β-ME. Derfor er det protein dialyseres 3 gange med PBS pH 7,4 ved en fortynding på 1:2000. </li><li> Label 1 mg DISC1 (598-785) med DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort sagt, opløses 1 mg / ml protein i PBS pH 7,4, og der tilsættes 5 mM TCEP at genvinde frie thiolgrupper. Der tilsættes 20 ul af DMF opløste farvestof til reaktionsblandingen, og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. </li><li> Dialyseres proteinet 3 x med PBS pH7,4 ved et forhold på 1:2000 i 2 timer hver. </li></ol> For yderligere at øge renheden af det mærkede protein et His 6-mærket baseret affinitets-oprensning på en Ni-NTA kolonne udføres. <ol start="4"><li> Vask 1 ml Ni-NTA-matrix (Qiagen, Tyskland) med 10 ml PBS pH 7,4. </li><li> Anvende det mærkede, dialyserede protein til søjlen og lade den køre over kolonnen langsomt. </li><li> Vask proteinet med 3 x 20 ml PBS pH 7,4 </li><li> Eluere proteinet med PBS pH 7,4, 500 mM imidazol dråbevis under overvågning af farvet bånd på Ni-NTA-søjle for at reducere eluatet volumen. </li><li> Dialysere eluatet 3 x med 10 mM NaPi pH 7,4 ved en fortynding på 1:2000 i 2 timer hver. </li><li> Bruge en steril 0,45 um sprøjte filter til at filtrere eluatet, alikvot på 5 x 100 pi prøver og snap fryser i flydende nitrogen. Den totale mængde af protein bør være fra 0,5 til 1 ug / ml i hver 100 pi aliquot. </li></ol> valgfri concentration trin <ol start="10"><li> For stereotactical rotte injektioner blev proteinet koncentreret 10-fold i en Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301). Den endelige buffer betingelse var 100 mM NaPi. </li></ol> α-synuclein Labeling Mærkning og rensning (Ni-NTA-søjle) af det rekombinante α-synuclein blev udført parallelt med DISC1 (598-785). Den samlede udgangsmateriale var 500 ug i stedet for 1 mg til DISC1 (598-785). 6. Behandling af Recipient SH-SY5Y Celler med mærkede Rekombinant DISC1 (598-785) Protein <ol><li> Frø 5x10 4 Modtager SH-SY5Y humane neuroblastomceller konstitutivt udtrykker GFP-DISC1 (598-854) på sterile dækglas i hver brønd i en plade med 24 brønde. </li><li> Læg mærkede protein til cellekulturmediet i en koncentration på 5 til 10 ug / ml og inkuberes i 48-72 timer. </li><li> Vask cellerne 3 x med PBS pH 7,4 og slukke udvindingellular fluorescens med 0,04% trypanblåt i 5 minutter. </li><li> Fikseres cellerne med 4% PFA i PBS pH 7,4 i 10 minutter på is, vaskes en gang med sterilt H2O og montere dækglassene på objektglas med forlænge guld med DAPI Mounting Medium (Invitrogen, USA). </li><li> Bekræft optagelsen / invasion af eksogent anvendt rekombinant protein ved colokalisering med rekrutterede proteiner udtrykt ved recipientceller i Z-stack billeder, der genereres ved hjælp af laser konfokal mikroskopi. Alligevel kan rekruttering af endogent protein ikke i det væsentlige påvises parallelt med invasion af værtscelleprotein, kan Z-stack billeder bekræfter stadig invasive karakter af proteinet. </li></ol> I vores eksempel rec. DISC1 (598-785) * i det mindste delvis rekrutter opløseligt GFP-mærket DISC1 (598-854) protein udtrykt af værtscellen (se figur 5A). For rekombinant α-synuclein invasion men ingen rekruttering er vist (figur 5B). Billeder blev tagetpå et Zeiss LSM 510 konfokal-eller et Zeiss AxioVision Apotome2 Microscope. Injektionen af ​​det koncentrerede (ca. 4 pi af 2,5 pg / pl), mærket DISC1 (598-785) * i de mPFC resulterer i spredning af proteinet omkring injektionsstedet, der kan detekteres selv efter perfusion af dyret med 4% PFA i PBS pH 7,4 med en rhodamin filterset. I vores eksempel DISC1 (598-785) optages af et særskilt antal neuroner og kan overvåges med Z-stack billeddannelse (fig. 6). Generelt har injektion af andre proteiner derefter dem der anvendes her ikke nødvendigvis føre til celle-invasion. Invasionen arrangement er i det væsentlige afhængig af naturen af ​​proteinet imidlertid en ren oprensning er en forudsætning for yderligere analyse. 7. Repræsentative resultater Aggresomes bestående af rekombinant FL DISC1-eGFP oprenset fra NLF celler invaderede modtager SH-SY5Y ceLLS ved lav effektivitet (ca. 0,3% 5), som set af colokalisering med konfokal mikroskopi (figur 3). Som tidligere rapporteret, DISC1 (598-785) udtrykt og oprenset fra E. coli dannede multimerer 4 var lige celle-invasiv ved en effektivitet på cirka 20% 5 (fig. 5A), der svarer til α-synuclein, der blev anvendt i parallel som positiv kontrol (figur 5B). Mærket rekombinant DISC1 (598-785) udtrykt og oprenset fra E. coli blev også celle-invasiv for neuroner in vivo, når det multimere protein blev stereotaktisk injiceret i den mediale præfrontale cortex hos en rotte (figur 6; Pum, Bader, Huston, Korth, ikke publiceret). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1.. NLF neuroblastomceller transient udtrykker FP-DISC1 (rød). Rød fluorescerende aggresomes kan være forværringCTED i cellerne. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Purified mRFP-mærket DISC1 aggresomes efter oprensning i en saccharosegradient. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Fluorescerende billede af invaderet aggresomes. mRFP-mærkede flDISC1 aggresomes blev oprenset og inkuberet med SH-SY5Y-neuroblastomaceller overudtrykker opløseligt GFP-mærket DISC1 (598-854). En optagelse af mærkede aggresomes overvåges af Z-stack imaging på en Laser-Scan mikroskop (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. SEC-profil rec. DISC1 (598-785), der indeholder S704 og C704 single nucleotide polymorphisms (SNP). Begge varianter viser en afbrydelse af bestilte oligomerisering og dannelsen af ​​højmolekylære multimers (rød pil). Dette billede er ændret fra offentliggørelsen af Leliveld et al., Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. Fluorescerende Z-stack billede af invasiv DyLight-mærket rekombinant DISC1 (598-785). SH-SY5Y-neuroblastomaceller udtrykker opløselig GFP-DISC1 (598-854) blev inkuberet med mærket, rekombinant protein i en koncentration på 5 ug / ml. (A) Røde aggregater viser invasionen af ​​rec. DISC1 (598-785) protein og gule prikker indikerer en rekruttering af opløselig GFP-DISC1 (598-854) til aggregater. (B) Rekombinant α-synuclein (rød) invaderer cellerne uden rekruttering med en frekvens på omkring 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">se større tal</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6. Immunfluorescens billede afden injicerede mærket, rekombinant DISC1 (598-785) protein. Z-stack imaging bekræfter tilstedeværelsen af ​​rec. DISC1 (598-785) protein i rotte-corticale neuroner farvet med et antistof mod neuronal nuclei (Neun, grøn).

<ol>
	<li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness.">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease.">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+(640-854)+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C.">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li><li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level:+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes.">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li><li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host.">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li><li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change.">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li><li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain.">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li><li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein.">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li><li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates.">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li><li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease.">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li><li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates.">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li><li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCopathies:+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1.">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

I denne undersøgelse beskrives oprensningen af mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes fra en transficeret neuroblastom-cellelinje, fremstilling og mærkning af et rekombinant DISC1 proteinart og deres anvendelse i celle-invasion eksperimenter recipientceller in vitro og in vivo. Oprensningen af native mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes blev udviklet fra protokoller til isolering af Lewy legeme-lignende strukturer og større aggregater 13, 14, men modificeret til at undgå brugen af detergenter og at minimere risikoen for falsk positive celle-invasion, som kan forekomme på grund af detergent-faciliteret membrangennemtrængning. En mulig fremtidig forbedring kan være i yderligere at øge renheden af ​​de aggresomes ved sonikering til helt adskilte tilbageværende membraner og cytoskeleton fra aggresomes. Ved at øge de samlede renhed, det samlede antal invasion begivenheder, der registreres for store aggresomes may forhøjes 5. , Om den begrænsede definition af vores foreslåede 3-fase sucrose er tilstrækkelig til aggresomes af andet protein arter skal testes, i den forstand protokollen beskrevet her, bør betragtes som et udgangspunkt for individuel optimering. De oprensede aggresomes sig at være ganske robust i vores hænder, yderligere vasketrin (uden detergent) for at fjerne spor af saccharose ikke signifikant reducere det samlede udbytte. I en tidligere publikation beskrev vi, at oligomer samling af DISC1 er afhængig af forskellige multimerisering domæner i den C-terminale ende 4 (figur 4). Vi valgte dette fragment for rekombinant opløselig ekspression i E. coli og efterfølgende og Ni-NTA-oprensning. For at overvåge sin multimerisering og sammenligne sin celle invasiv med en beskrevet celle-invasiv protein som α-synuclein, vi mærkede DISC1 (598-785) med det fluorescerende farvestof DyLight594, og sammenlignet sincelle-invasionsevne med den for lige mærket α-synuclein. Den celle-invasionsevne af det rekombinante DISC1 fragmentet blev dramatisk forøget sammenlignet med den for nativ, fuld længde DISC1 aggresomes, sandsynligvis på grund af deres mindre størrelse og større renhed. Igen, renhed synes at spille en afgørende rolle i celle-invasionsevne. I vores eksempel de invasive aggresomes rekrutteret opløseligt homolog protein ifølge målcellelinie, der udtrykkes rekombinant i en opløselig, dvs celle-dispergeret form. Ekspressionen af et fluorescerende protein (f.eks GFP eller RFP) i modtagerens cellelinie er en fordel, eftersom den muliggør colokalisering af invasive aggresomes og rekombinante proteiner i recipientcellen grænse via Z-stack billeddannelse. Celle-invasive DISC1 aggresomes og multimere fragmenter udtrykt og oprenset fra E. coli kunne være et definerende træk ved et protein konformationelle sygdomme i forbindelse med DISC1, DISC1opathies 15. Trouble shooting: Lavt aggresome udbytte efter saccharosegradient oprensning: Saccharosegradienten introduceres i denne protokol fungerer godt med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående af andre proteiner kan være af variable dimensioner derfor saccharose-koncentrationer bør optimeres af andre brugere. Utilstrækkelig oprensning af rekombinant protein: Eventuelle bakterielle forurenende stoffer i oprensningsprocessen for det rekombinante protein vil også mærkes i senere trin i protokollen. For at undgå kontaminering, køres proteinet på en SDS-PAGE og bekræfter, at det rekombinante protein er mindst 95% rent ved farvning med Coomassie-blå. At sikre den højeste kvalitet og udbytte, protokollen skal optimeres for hvert enkelt protein. Lav mærkning eftet af rekombinante proteiner: Eventuelle forureninger, der indeholder frie SH-grupper vil falde effektiv mærkning af proteinet. Derfor omfattende dialyse og Ni-NTA-baseret oprensning er obligatorisk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens navn </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medium afhænger af værtscellelinien. Den optimale modtager cellelinie bestemmes af brugeren. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medium afhænger af modtagerens cellelinien. Den optimale modtager cellelinie bestemmes af brugeren. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andre transfektionsreagenser kan fungere lige så godt, men blev ikke testet med vores protokol. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30.210 &lt;/ Td&gt; <td> Forsøgene blev udført med Ni_NTA agarose fra Qiagen, bør andre leverandører arbejde så godt. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Der er ikke behov for RNase free DNase i færd med aggresomes oprensning. </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serumfrit medium fungerer så godt </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Tillæg for SH-SY5Y og NLF medium </td></tr><tr><td> Ikke-essentielle-aminosyrer (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Tillæg for SH-SY5Y medium </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Giftig reagens </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46.608 </td><td> Reduceret cystein reaktivt farvestof til dannelse af stabile thioetherbindinger. Fås også i andre farver. </td></tr><tr><td> Forlæng Guld med DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Denne antiblegemiddel væske indlejringsolie gav bedre resultater i vores hænder. </td></tr><tr><td> Proteaseinhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Opløs 1 tabellen i 500 pi H2O til 100X opløsning. </td></tr><tr><td> Syntetisk a-synuclein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Refold som beskrevet i teksten. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel af specifikke reagenser. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Vi har ikke testet andre mekaniske homogennizers andre end dette. Andre vaskemiddel uden homogenisering metode kan arbejde så godt, men er ikke blevet testet for denne protokol. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Kun nødvendig, hvis proteinet skal koncentreres. </td></tr><tr><td> LSM 510 og AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Se fabrikanter katalog </td><td> Begge mikroskoper harbor evnen til at udføre Z-stack billeddannelse. Dette er en forudsætning for solid og seriøs evaluering af invasions begivenheder. </td></tr><tr><td> Cellekultur plastmateriale </td><td> Nunc </td><td> 10 cm skåle # 172958, 24-brønds plader # 142475 </td><td> Anvendelsen af ​​forskellige plastmaterialer kan påvirke interaktionen af ​​rekombinante proteiner eller aggresomes og plastoverflader. Vi har ikke testet andre materialer end dem, der er beskrevet her. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel over særligt materiel og udstyr. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nummer </td><td> Buffer navn </td><td> indhold </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bakterievækstmedium </td><td> 16 g / l Bacto trypton, 10 g / l Bacto gærekstrakt, 5 g / l NaCl, 5 mM-arginin-HCI, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chloramphenicol </td><td> Vokse bakterier til OD600: 0,6-0,8 inducere ekspression med 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakteriel resuspensionsbuffer </td><td> 50 mM TRIS-HCI pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 og 400 U/50 ml DNase I </td><td> Resupend bakteriel pellet fra 1 L overnight kultur i 50 ml resuspensionsbuffer. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein ekstraktionspuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCI, 8 M urea og 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA søjle vaskepuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCI, 8 M urea og 10 mM b-ME, 12 mM imidazol </td><td> Modificeret ekstraktionspuffer med 12 mM imidazol tilsat. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA søjle elueringspuffer </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCI, 300 mM imidazol, 8 M urinstof, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA og 10 mM b-ME </td><td> Elueringspufferen indeholder 10 mM b-ME, som dialyseres senere. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCI, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, justeres til pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Labeling buffer </td><td> PBS indeholdende 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabel over opskrifter. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Proteinaggregering ses som en generelt kendetegn for kroniske, degenerative hjernesygdomme såsom for eksempel i neurodegenerative sygdomme Alzheimers sygdom (Ap, tau), Parkinsons sygdom (α-synuclein), Huntingtons sygdom (polyglutamine, huntingtin), og andre. Proteinaggregering menes at opstå på grund af forstyrret proteostasis, dvs ubalancen mellem opstår og nedbrydning af fejlfoldede proteiner. Det skal bemærkes, er de samme proteiner fundet sammen i de sporadiske former af disse sygdomme, som er mutant i sjældne varianter af familiær former. Skizofreni er en kronisk fremadskridende hjernesygdom betingelse, at i mange tilfælde går sammen med en permanent og irreversibel kognitive underskud. I et kandidatgen fremgangsmåde, undersøgt om Forstyrret in skizofreni 1 (DISC1), et gen klonet i en skotsk familie med binding til kronisk mental sygdom 1, 2, kunne findes som uopløselige aggregater i brain af sporadiske tilfælde af skizofreni 3. Ved hjælp af SMRI CC, vi identificerede i cirka 20% af tilfældene med CMD men ikke normale kontroller eller patienter med neurodegenerative sygdomme sarkosyl-uopløselig DISC1 immunoreaktivitet efter biokemisk fraktionering. Efterfølgende undersøgelser in vitro viste, at aggregering tilbøjelighed DISC1 er påvirket af sygdom-associeret polymorfi S704C 4, og at DISC1 aggresomes genereret in vitro var celle-invasiv 5, ligner det, der var vist for Ap 6, tau 7-9, α -synuclein 10, polyglutamine 11 eller SOD1 aggregater 12. Disse resultater fik os til at foreslå, at i det mindste en delmængde af tilfælde med CMD, kan dem med aggregeret DISC1 være protein konformationelle lidelser. Her beskriver vi, hvordan vi genererer DISC1 aggresomes i mammale celler, rense dem på en sucrosegradient og bruge dem til celle-invasionsevne Studies. Ligeledes beskriver vi, hvordan vi genererer en udelukkende multimere C-terminal DISC1 fragment, etiket og rense det for celle invasionsevne undersøgelser. Anvendelse af de rekombinante multimerer af DISC1 vi opnå samme celle invasivitet som for et tilsvarende mærket syntetisk α-synuclein fragment. Vi viser også, at dette fragment optages in vivo, når stereotaktisk injiceret i hjernen hos recipientdyr.

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Den generation, oprensning og celleinvasion af intracellulære, cytoplasmatiske fuld længde DISC1 protein aggresomes fra cellekulturer og af en mærket, multimert rekombinant DISC1 proteinfragment i<em&gt; E. coli</em&gt; Beskrives. Cell invasionsevne er vist for recipientceller i cellekultur og for neuroner<em&gt; In vivo</em&gt; Efter stereotactical hjerne podning.

Produktion, oprensning og karakterisering af Cell-invasive DISC1 proteinarter

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatiseret hydrofobisk interaktions-kromatografi Kolonne Valg til brug i Proteinoprensning

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifikation af Protein Interagerende Partners Brug Tandem Affinitetsrensning

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identifikation og karakterisering af protein glycosylation bruge specifikke endo-og exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri metode til Binding Affinity Bestemmelse ved Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Afsløring, visualisere og kvantificering af generation af reaktive ilt arter i en amøbe Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifikation af protein-protein interaktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Voksen Heads af Tandem Affinitetsrensning (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...