Name: generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door NEURON-ERANET ontdekken (BMBF 01EW1003) naar CK en JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) om CKVB wordt ondersteund door een subsidie ​​van de Forschungskommission van de Medische Faculteit van de Universiteit van Düsseldorf.

1. Bereiding van aggresoom donorcellen: Transfectie van Monomeer Red Fluorescent Protein (mRFP) of versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP)-gelabeld Human volledige lengte (FL) DISC1 <ol><li> Zaad 1,5 x 10 6/10 cm schotel menselijke neuroblastoom NLF (NLF; Children&#39;s Hospital van Philadelphia, Philadelphia, PA) cellen in tien schalen van 10 cm en groeien &#39;s nachts. NLF cellen worden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, penicilline / Strepomycin, L-Glutamine. De volgende dag moeten cellen bij 70-80% confluentie. </li><li> Tijdelijk transfecteren elk 10 cm schaal met 15 ug plasmide-DNA en Metafectene transfectiereagens (Biontex, Martinsried, Duitsland). Kortom voor een 10 cm schaal, werd 15 ug plasmide-DNA en 30 pl Metafectene aan 750 pl Opti-MEM, gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. 5 schalen werden getransfecteerd met pcDNA3.1 mRFP / eGFP-gelabeld humaan (FL) DISC1 en 5 schotels met eGFP-plasmide alleen. </li></ol> 2. AggresoomZuivering van getransfecteerde cellen Donor De hier beschreven protocol is een combinatie van een methode om Lewy-lichamen zuiveren van hersenweefsel 13 en een protocol om grote aggregaten en aggresomes 14 isoleren. Omdat bestaande methoden berusten op het gebruik van detergentia, de isolatie van detergens vrij proteïne voor toepassing in cel-assays invasiviteit is kritisch. <ol><li> 48 uur na transfectie, bewaken de expressie van eGFP en mRFP/eGFP-DISC1 en bevestigen de vorming van aggresomes onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 1). </li><li> Spoel de cellen met PBS pH 7,4, schrapen met 400 pi PBS per Voeg 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) en verstoren de cellen door een Precellys24 homogenisator (Bertin technologieën, Frankrijk). In het kort, voeg 1 ml celsuspensie op een 2 ml lysis buis en voeg 10 keramiek kralen. Lyse van de cellen met 3 x 60 sec pulsen. De mechanische kracht van het proces kanverhogen van de temperatuur in het monster boven 37 ° C, zodat voorzichtigheid is geboden aan het monster koelen op ijs na lysis procedure. </li><li> Koel de cellen op ijs en voeg 10 mM MgCl2, 40 U / ml DNase A en incubeer 60 min bij 37 ° C </li><li> Bereid oplossingen van 80%, 50%, 20% sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml elk). </li><li> Bereid de sucrose gradiënt in een 15 ml falcon-buis, te beginnen met 2 ml 80% sucrose, gevolgd door 50% en 20%. Giet langzaam de helling en wees voorzichtig dat u reeds gegoten lagen te verstoren. Laag de verkregen lysaat bovenop de gradiënt en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C. </li><li> Zorgvuldig verzamelen interface tussen de 50-80% sucrose laag met een pipet en meng met 5 volumina PBS pH 7,4. Centrifugeer gedurende 15 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Herhaal het wassen van twee extra keer. In deze interfase, aggresomes zijn fluorescerend en kunnen worden gevisualiseerd in een microscoop onder UV-licht. </li><li> Verwijder het supernatant enresuspendeer de pellet op 250-500 ul PBS pH 7,4. Deze pellet bevat het gezuiverde aggresomes (figuur 2). </li></ol> 3. Behandeling van Ontvanger SH-SY5Y Cellen met mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Zaad 5 x 10 4 ontvanger SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen constitutief tot expressie GFP-DISC1 (598-854) op steriele dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes. SH-SY5Y cellen worden gekweekt in DMEM/F-12 medium aangevuld met penicilline / streptomycine, niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 10% FBS. </li><li> 24 uur later, wordt 10 pi aan elk putje en incubeer gedurende 48-72 uur. </li><li> Spoel de cellen met 3 x PBS pH 7,4 en doof extracellulaire fluorescentie met 0,04% Trypan Blue gedurende 5 minuten. </li><li> Bevestig de cellen met 4% PFA in PBS pH 7,4 gedurende 10 min op ijs, eenmaal wassen met steriel H2O en monteren dekglaasjes op glasplaatjes met ProLong Gold met DAPI fixeermiddel (Invitrogen, USA). </li><li> Bevestig de opname /invasie van exogeen toegepaste aggresomes door colokalisatie met aangeworven eiwitten die door ontvangende cellen in Z-stack beelden. </li></ol> Toch kan opname / invasie van exogeen eiwit niet wezenlijk worden gedetecteerd in parallel met rekrutering gastheercel eiwit. In ons voorbeeld mRFP gemerkte DISC1 aggresomes werven oplosbaar GFP-gelabeld DISC1 (598-854) proteïne uitgedrukt door de gastheercel (zie figuur 3). Foto&#39;s werden genomen op een Zeiss LSM 510 confocale-of een Zeiss AxioVision Apotome2 Microscoop. 4. Generatie van recombinant DISC1 (598 tot 785) In een eerdere publicatie analyseerden we het vermogen van diverse DISC1 eiwitfragmenten om zelf interactie gebaseerd op de aanwezigheid van zelfassociatie domeinen. Van alle geteste menselijke eiwitfragmenten DISC1 (598-785) weergegeven sterkste multimerisatie propensity 4 (Figuur 4). Daarom werd de menselijke DISC1 (598-785) gekloneerd in pET15b (nr.vagen, Madison, Wisconsin) die een N-terminale 6-histidine tag, uitgedrukt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, VS) en gezuiverd onder denaturerende omstandigheden in 8 mol / l ureum zoals beschreven 4. In het kort, is het protocol hieronder beschreven. <ol><li> BL21-(ide3) Rosetta E. coli werden gekweekt in 2 x 500 ml 2YT dat 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chlooramfenicol tot een OD 600: 0,6-0,8 en DISC1 (598-785) expressie werd geïnduceerd met 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) werd uitgedrukt gedurende 4 uur bij 37 ° C werd de expressie beëindigd door het oogsten van de bacteriën door centrifugatie. </li><li> De bacteriële pellet werd geresuspendeerd in 50 ml TE buffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 en 400 ml U/50 DNase I. Om volledige lysis te verzekeren, werd het reactiemengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren. </li><li> Voeg 10 mM β-mercaptoethanol (ME) en 500 mM NaCl en incubeer 30 min een. </li><li> Spin down bacteriële insluitlichaampjes op 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Hersuspendeer pellet in 50 ml extractiebuffer bevattende 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM β-ME en verwijder afval door centrifugatie bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Was de Ni-NTA agarose matrix met extractiebuffer. Incubeer de geresuspendeerde, vooraf geklaard eiwitextract met Ni-NTA matrix gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Was de Ni-NTA matrix met extractiebuffer bevattende 12 mM imidazool. </li><li> Langzaam Elueer het eiwit met 15 ml elutiebuffer die 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazool, 8 M ureum, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA en 10 mM β-ME. </li><li> Dialyseer het eiwit stapsgewijs te PBS pH 7,4 bevattende 10 mM β-ME. </li></ol> Vanaf 1 L bacteriële starten cultuur is het mogelijk om tot isoleren tot 50 mg recombinant DISC1 (598 tot 785) protein. α-synucleïne hervouwing Voor experimenten met α-synucleïne, 500 ug van het recombinante eiwit (Sigma-Aldrich, USA) werd opgelost in PBS bij een concentratie van 1 mg / ml. Oligomeren verkrijgen hervouwing werd gedurende de nacht bij 37 ° C zoals beschreven in een eerdere publicatie 10. 5. Etikettering van Recombinant DISC1 (598 tot 785) met DyLight594 <ol><li> Voorafgaand het naderhand coderen proces, DISC1 (598 tot 785) eiwit is het bevrijd worden van β-ME. Derhalve wordt het eiwit gedialyseerd 3 keer met PBS pH 7,4 bij een verdunning van 1:2000. </li><li> Label 1 mg DISC1 (598-785) met DyLight 594 maleïmide (Thermo Scientific, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, los 1 mg / ml eiwit in PBS pH 7,4 en voeg 5 mM TCEP om vrije thiolgroepen te herstellen. Voeg 20 ul van de DMF opgeloste kleurstof aan de reactie en incubeer gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Dialyseer het eiwit tot 3 x PBS pH7,4 bij een verhouding van 1:2000 voor 2 uur elk. </li></ol> Verdere verhoging van de zuiverheid van het gelabelde eiwit een His6-tag based affiniteit-zuivering op een Ni-NTA kolom uitgevoerd. <ol start="4"><li> Wash 1 ml Ni-NTA matrix (Qiagen, Duitsland) met 10 ml PBS pH 7,4. </li><li> Breng de gelabelde, gedialyseerd eiwit aan de kolom en laat hem langzaam lopen over de kolom. </li><li> Was het eiwit met 3 x 20 ml PBS pH 7,4 </li><li> Elueer het eiwit met PBS pH 7,4, 500 mM imidazool druppelsgewijze onder controle van de gekleurde band op de Ni-NTA kolom het eluaat volume te verlagen. </li><li> Dialyseer het eluaat 3 x met 10 mM NaPi pH 7,4 bij een verdunning van 1:2000 gedurende 2 uur elk. </li><li> Een steriele 0,45 urn spuitfilter het eluaat aliquot in 5 x 100 ul monsters en snap bevriezen in vloeibare stikstof filteren. De totale hoeveelheid eiwit moet 0,5 - 1 ug / ml per 100 ul aliquot. </li></ol> optionele concentratie stap <ol start="10"><li> Voor stereotactical rat injecties werd het eiwit 10-voudig geconcentreerd in een Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301). De laatste buffer voorwaarde was 100 mM NaPi. </li></ol> α-synucleïne Labeling De labeling en zuivering (Ni-NTA kolom) van de recombinant α-synucleïne werd uitgevoerd parallel aan DISC1 (598-785). Het totale uitgangsmateriaal was 500 ug plaats van 1 mg DISC1 (598-785). 6. Behandeling van Ontvanger SH-SY5Y Cellen met gemerkt recombinant DISC1 (598 tot 785) Protein <ol><li> Seed 5x10 4 Ontvanger SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen constitutief tot expressie GFP-DISC1 (598-854) op steriele dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes. </li><li> Toevoegen gemerkt eiwit aan het celkweekmedium in een concentratie van 5-10 ug / ml en incubeer gedurende 48-72 uur. </li><li> Was de cellen 3 x met PBS pH 7,4 en lessen extractieellular fluorescentie met 0,04% Trypan Blue gedurende 5 minuten. </li><li> Bevestig de cellen met 4% PFA in PBS pH 7,4 gedurende 10 min op ijs, eenmaal wassen met steriel H2O en monteren dekglaasjes op glasplaatjes met ProLong Gold met DAPI fixeermiddel (Invitrogen, USA). </li><li> Bevestig de opname / invasie van exogeen toegepaste recombinant eiwit door colokalisatie met aangeworven eiwitten die door ontvangende cellen in Z-stack beelden gegenereerd door laser scanning confocale microscopie. Toch werving van endogeen eiwit niet kan worden gedetecteerd in hoofdzaak parallel met invasie van gastheercel eiwit, kan Z-stack beelden nog bevestigen het invasieve karakter van het eiwit. </li></ol> In ons voorbeeld rec. DISC1 (598-785) * tenminste gedeeltelijk oplosbaar rekruten GFP-gelabeld DISC1 (598-854) proteïne uitgedrukt door de gastheercel (zie figuur 5A). Voor recombinant α-synucleïne invasie maar geen rekrutering (Figuur 5B). Foto&#39;s zijn genomeneen Zeiss LSM 510 confocale-of een Zeiss microscoop AxioVision Apotome2. De injectie van de geconcentreerde (ca. 4 pl van 2,5 ug / ul), gelabeld DISC1 (598-785) * in de mPFC leidt tot het verspreiden van het eiwit rond de injectieplaats die zelfs na perfusie van de dieren worden gedetecteerd met 4% PFA in PBS pH 7,4 met een rhodamine filterset. In ons voorbeeld DISC1 (598-785) wordt opgenomen door een afzonderlijk aantal neuronen en kunnen door Z-stack imaging (Figuur 6). In het algemeen hebben de injectie van eiwitten anders dan die welke worden gebruikt hier niet te leiden tot cel-invasie. De invasie event is voornamelijk afhankelijk van de aard van het eiwit toch een schone zuivering is een voorwaarde voor verdere analyse. 7. Representatieve resultaten Aggresomes bestaande uit recombinant FL DISC1-eGFP gezuiverd van NLF cellen binnengevallen ontvanger SH-SY5Y ceLLS bij lage efficiëntie (ongeveer 0,3% 5) zoals zichtbaar colokalisatie met confocale microscopie (figuur 3). Zoals eerder gemeld, DISC1 (598-785) uitgedrukt en gezuiverd uit E. coli gevormd multimeren 4 waren even cell-invasieve bij een rendement van ongeveer 20% 5 (Figuur 5A) gelijk aan die van α-synucleïne dat in parallel als positieve controle (Figuur 5B). Gelabeld recombinant DISC1 (598-785) uitgedrukt en gezuiverd uit E. coli was ook cel-invasieve aan neuronen in vivo wanneer het multimere eiwit stereotactisch geïnjecteerd in de mediale prefrontale cortex van de rat (figuur 6; Pum, Bader, Huston, Korth, ongepubliceerd). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. NLF neuroblastomacellen transiënt tot expressie FP-DISC1 (rood). Rode fluorescerende aggresomes kan verslechteringcted in de cellen. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Gezuiverd mRFP gemerkte DISC1 aggresomes na zuivering in een sucrosegradiënt. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Fluorescentie beeld van binnengevallen aggresomes. mRFP-gelabeld flDISC1 aggresomes werden gezuiverd en geïncubeerd met SH-SY5Y neuroblastoomcellen overexpressie oplosbaar GFP-gelabeld DISC1 (598-854). Een opname van gelabelde aggresomes wordt bewaakt door Z-stack beeldvorming op een Laser-Scan microscoop (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. SEC-profiel van rec. DISC1 (598 tot 785) met de S704 en de C704 single nucleotide polymorfismen (SNP). Beide varianten tonen een verstoring van geordende oligomerisatie en vorming van hoog molecuulgewicht multimers (rode pijl). Dit beeld wordt aangepast na de publicatie van Leliveld et al.., Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Fluorescent Z-stack beeld van invasieve DyLight-gelabeld recombinant DISC1 (598 tot 785). SH-SY5Y neuroblastoomcellen expressie oplosbaar GFP-DISC1 (598-854) werden geïncubeerd met gemerkt, recombinant eiwit in een concentratie van 5 ug / ml. (A) Red aggregaten toont de invasie van rec. DISC1 (598 tot 785) eiwit en gele stippen geven een werving van oplosbare GFP-DISC1 (598 tot 854) in aggregaten. (B) Recombinant α-synucleïne (rood) binnendringt de cellen zonder recruitment met een frequentie van ongeveer 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Immunofluorescente beeld vande geïnjecteerde gelabelde recombinant DISC1 (598-785) eiwit. Z-stack beeldvorming bevestigt de aanwezigheid van rec. DISC1 (598-785) eiwit in rat corticale neuronen gekleurd met een antilichaam tegen neuronale kernen (neun, groen).

<ol>
	<li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness.">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease.">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+(640-854)+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C.">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li><li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level:+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes.">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li><li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host.">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li><li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change.">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li><li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain.">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li><li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein.">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li><li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates.">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li><li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease.">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li><li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates.">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li><li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCopathies:+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1.">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In deze studie beschrijven we de zuivering van mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes uit getransfecteerde neuroblastoma cellijn, de bereiding en het kenmerken van een recombinant eiwit DISC1 species en hun toepassing in cel-invasie experimenten ontvangende cellen in vitro en in vivo. De zuivering van natieve mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes werd ontwikkeld uit protocollen Lewy body-achtige structuren en grotere aggregaten 13, 14 isoleren, maar aangepast om het gebruik van detergenten voorkomen en het risico op vals-positieve cel-invasie die zich kunnen voordoen minimaliseren als gevolg van detergent-gefaciliteerde membraan penetratie. Een mogelijke toekomstige verbeteringen kan de in de zuiverheid van de aggresomes door sonicatie verder stijgen tot volledig gescheiden blijven membranen en het cytoskelet aggresomes. Door de totale zuiverheid, het totaal aantal gebeurtenissen die invasie opgenomen voor grote ma aggresomesy worden verhoogd 5. Of de beperkte definitie van onze voorgestelde 3-fase sucrose is voldoende voor aggresomes andere eiwitsoort worden getest, in die zin de hier geschetste protocol moet worden beschouwd als uitgangspunt voor individuele optimalisatie. Het gezuiverde aggresomes bleek vrij robuust in onze handen, extra wasstappen (zonder detergent) om sporen sucrose niet significant verminderen de totale opbrengst elimineren. In een eerdere publicatie beschreven we dat oligomeer samenstel van DISC1 is afhankelijk van verschillende multimerisatie domeinen in het C-terminus 4 (Figuur 4). We kozen voor dit fragment voor recombinante expressie in E. oplosbaar coli en daaropvolgende en Ni-NTA zuivering. Om de multimerisatie volgen en de cel invasiviteit vergelijken met een beschreven cel-invasieve eiwit zoals α-synucleïne, we gemerkte DISC1 (598-785) met de fluorescente kleurstof DyLight594, en vergeleken decel-invasiviteit met die van gelijk gelabelde α-synucleïne. De cel-invasiviteit van de recombinant DISC1 fragment werd enorm toegenomen vergeleken met die van natief, volledige lengte DISC1 aggresomes waarschijnlijk door de geringe afmetingen en veel hogere zuiverheid. Nogmaals, zuiverheid lijkt een beslissende rol spelen in cel-invasiviteit. In ons voorbeeld invasieve aggresomes gerekruteerd oplosbare homoloog eiwit van de doelcellijn dat recombinant expressie werd gebracht in een oplosbare, dwz cel-gedispergeerde vorm. De expressie van een fluorescerend eiwit (GFP of RFP bijvoorbeeld) in de ontvangende cellijn een voordeel aangezien het de colokalisatie van invasieve aggresomes en recombinante eiwitten in de ontvangende cel grens via Z-stack imaging. Cell-invasieve DISC1 aggresomes en multimere fragmenten tot expressie gebracht en gezuiverd uit E. coli kan een bepalend kenmerk van een eiwit conformationele ziekten in verband met DISC1, DI wordenSC1opathies 15. PROBLEMEN OPLOSSEN: Laag aggresoom opbrengst na sucrose gradiënt zuivering: De sucrose-gradiënt die in dit protocol werkt goed met eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestaande uit andere eiwitten kan van variabele afmetingen dan de concentraties sucrose moeten worden geoptimaliseerd door andere gebruikers. Onvoldoende zuivering van recombinant eiwit: Een bacteriële verontreinigingen in het zuiveringsproces van het recombinante eiwit worden geëtiketteerd latere stappen van het protocol. Om verontreinigingen te voorkomen, voert het eiwit op SDS-PAGE en bevestigen dat het recombinant eiwit ten minste 95% zuiver door kleuring met Coomassie-Blue. Te waarborgen hoogste kwaliteit en opbrengst, het protocol moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit. Lage etikettering efficiëntie van recombinante eiwitten: Alle verontreinigingen die vrije SH-groepen bevatten afneemt efficiënte labeling van het eiwit. Daarom uitgebreide dialyse en Ni-NTA based zuivering verplicht.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medium is afhankelijk van de gastheercellijn. De optimale ontvangende cellijn worden bepaald door de gebruiker. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medium is afhankelijk van de ontvangende cellijn. De optimale ontvangende cellijn worden bepaald door de gebruiker. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andere transfectiereagentia kan net zo goed werken, maar zijn niet getest met ons protocol. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> De experimenten werden gedaan met Ni_NTA agarose van Qiagen, moeten andere leveranciers zo goed werkt. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Er is geen noodzaak voor RNase vrij DNase in het proces van aggresomes zuivering. </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serumvrij medium werkt ook </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Toeslag voor SH-SY5Y en NLF medium </td></tr><tr><td> Niet-essentiële amino-zuren (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Toeslag voor SH-SY5Y medium </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Giftige reagens </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Verminderd cysteine ​​reactieve kleurstof stabiele thioether bindingen. Ook verkrijgbaar in andere kleuren. </td></tr><tr><td> ProLong Gold met DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Dit antifade vloeibare inbedmiddel superieure resultaten gaf in onze handen. </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Los 1 tabel in 500 pi H 2 O voor 100X oplossing. </td></tr><tr><td> Synthetische a-synucleïne </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Vouw zoals beschreven in de tekst. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel van specifieke reagentia. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> We hebben niet getest andere mechanische homonizers anders dan dit. Andere wasmiddel zonder homogenisering methode kan net zo goed werken, maar zijn niet getest op dit protocol. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Alleen nodig wanneer eiwit worden geconcentreerd. </td></tr><tr><td> LSM 510 en AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Zie fabrikanten catalogus </td><td> Beide microscopen haven de mogelijkheid om Z-stack beeldvorming uit te voeren. Dit is een voorwaarde voor vaste en serieuze evaluatie van de invasie evenementen. </td></tr><tr><td> Celcultuur kunststof </td><td> Nunc </td><td> 10 cm schalen # 172958, 24-well platen # 142475 </td><td> Het gebruik van verschillende kunststof beinvloeden de interactie van recombinante eiwitten of aggresomes en plastic oppervlakken. We hebben niet getest materiaal andere dan de hier beschreven. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel van specifieke materialen en apparatuur. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Aantal </td><td> Buffer naam </td><td> inhoud </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bacteriële groeimedium </td><td> 16 g / l Bacto trypton, 10 g / l Bacto gistextract, 5 g / l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml chlooramfenicol </td><td> Bacteriën groeien OD 600: 0.6-0.8 induceren expressie met 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bacteriële resuspensie buffer </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml lysozym, 20 mM MgCl2 en 400 U/50 ml DNase I </td><td> Resupend bacteriële pellet van 1 L overnight cultuur in 50 ml resuspensie buffer. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein extractiebuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA kolom wasbuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazool, 500 mM NaCl, 8 M ureum en 10 mM b-ME, 12 mM imidazool </td><td> Gemodificeerde extractiebuffer met 12 mM imidazool toegevoegd. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA kolom elutiebuffer </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazool, 8 M ureum, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA en 10 mM b-ME </td><td> De elutiebuffer bevat 10 mM b-ME, die later gedialyseerd. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2PO 4, op pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Labeling buffer </td><td> PBS met 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabel met recepten. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Eiwitaggregatie wordt gezien als een algemeen kenmerk van chronische, degeneratieve hersenaandoeningen zoals bijvoorbeeld in neurodegeneratieve ziekten ziekte van Alzheimer (Aß, tau), ziekte van Parkinson (α-synucleïne), de ziekte van Huntington (polyglutamine, huntingtin) en anderen. Eiwit aggregatie wordt gedacht dat optreden als gevolg van verstoorde proteostasis, dat wil zeggen het onevenwicht tussen het ontstaan ​​en afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten. Van belang zijn dezelfde eiwitten samengevoegd in sporadische vormen van deze ziekten die mutant in zeldzame varianten van familiaire vormen. Schizofrenie is een chronische progressieve hersenaandoening die samen in veel gevallen gaat met een permanente en onomkeerbare cognitieve tekorten. In een kandidaatgen benadering hebben we onderzocht of Onderbroken-in-schizofrenie 1 (DISC1), een gen gekloneerd in Schotse familie met koppeling aan chronische geestesziekte 1, 2, kunnen worden gevonden als onoplosbare aggregaten in de brain van sporadische gevallen van schizofrenie 3. Met de SMRI CC identificeerden we in ongeveer 20% van de gevallen met CMD maar niet de normale controles en patiënten met neurodegeneratieve ziekten sarkosyl onoplosbare DISC1 immunoreactiviteit na biochemische fractionering. Latere studies in vitro aangetoond dat de aggregatie neiging van DISC1 werd beïnvloed door ziekte geassocieerde polymorfismen S704C 4 en dat DISC1 aggresomes gegenereerd in vitro werden cel-invasieve 5, vergelijkbaar met wat is aangetoond voor Aß 6, tau 7-9, α -synucleïne 10, polyglutamine 11 of SOD1 aggregaten 12. Deze bevindingen ons ertoe stellen dat ten minste een subset van gevallen met CMD, die met geaggregeerde DISC1 misschien eiwit conformationele aandoeningen. Hier beschrijven we hoe we DISC1 aggresomes in zoogdiercellen te genereren, te zuiveren ze op een sucrose gradiënt en gebruik ze voor cel-invasiviteit studies. Ook beschrijven we hoe we een exclusief multimere C-terminale fragment DISC1, label genereren en zuiveren voor cel invasiviteit studies. Gebruik van de recombinante multimeren van DISC1 we bereiken soortgelijke cel als invasiviteit een vergelijkbaar gemerkte synthetische α-synucleïne fragment. We zien dat dit fragment wordt opgenomen in vivo als stereotactisch geïnjecteerd in de hersenen van de ontvanger dieren.

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

De generatie, zuivering en celinvasie van intracellulaire, cytoplasmatische volledige lengte DISC1 eiwit aggresomes van celculturen en van een label, multimeer recombinant DISC1 eiwitfragment in<em&gt; E. coli</em&gt; Beschreven. Cell invasiviteit wordt getoond voor ontvangende cellen in celkweek en neuronen<em&gt; In vivo</em&gt; Na stereotactical hersenen inoculatie.

Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Zuivering van het M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome geassocieerd eiwit MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...