Name: generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00
Duration: 14 min 33 s
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Ce travail a été financé par NEURON-ERANET DISCover (BMBF 01EW1003) à CK et JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) à CKVB est soutenu par une subvention de l&#39;Forschungskommission de la Faculté de médecine de l&#39;Université de Düsseldorf.

1. Préparation des cellules donateurs Aggresome: Transfection de monomère Red Fluorescent Protein (mRFP) ou Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Longueur étiqueté humain complet (FL) DISC1 <ol><li> Graine de 1,5 x 10 6/10 cm neuroblastome humain plat NLF (NLF; Hôpital pour enfants de Philadelphie, Philadelphie, PA) des cellules dans dix boîtes de 10 cm et se développer durant la nuit. Cellules du FLN sont cultivées dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS, pénicilline / Strepomycin, L-glutamine. Le lendemain, les cellules doivent être à 70-80% de confluence. </li><li> Transfecter de manière transitoire chaque plat 10 cm avec 15 pg d&#39;ADN plasmidique et réactif de transfection Metafectene (Biontex, Martinsried, Allemagne). En bref, pour un plat de 10 cm, 15 ug d&#39;ADN plasmidique et 30 Metafectene ul ont été ajoutés à 750 ul d&#39;Opti-MEM, mélangés et incubés à température ambiante pendant 20 min. 5 plats ont été transfectées avec pcDNA3.1 mRFP / eGFP-étiquette de l&#39;homme (FL) DISC1 et 5 plats avec le seul eGFP-plasmide. </li></ol> 2. AggresomePurification à partir de cellules transfectées donateurs Le protocole décrit ici est une combinaison d&#39;une méthode pour purifier Lewy-organismes à partir du 13 tissu cérébral et un protocole pour isoler gros agrégats et aggresomes 14. Puisque les méthodes existantes sont basées sur l&#39;utilisation de détergents, l&#39;isolement des sans détergent protéines pour l&#39;application dans la cellule-invasif des tests est cruciale. <ol><li> 48 heures après la transfection, contrôler l&#39;expression de eGFP et mRFP/eGFP-DISC1 et confirmer la formation de aggresomes sous un microscope à fluorescence (Figure 1). </li><li> Laver les cellules avec du PBS pH 7,4, gratter avec 400 ul de PBS chacun, ajouter 1X cocktail inhibiteur de la protéase (Roche, Indianapolis, IN) et de perturber les cellules en utilisant un homogénéisateur Precellys24 (Bertin Technologies, France). En bref, ajouter 1 ml de suspension cellulaire à un tube de 2 ml lyse et ajouter 10 billes de céramique. Lyse des cellules avec 3 impulsions x 60 sec. La force mécanique du processus peutaugmenter la température à l&#39;intérieur de l&#39;échantillon supérieure à 37 ° C si les soins doivent être prises pour refroidir l&#39;échantillon sur la glace après la procédure de lyse. </li><li> Refroidir les cellules sur de la glace et ajouter 10 mM MgCl 2, 40 U / ml de DNase A et incuber pendant 60 min à 37 ° C </li><li> Préparer des solutions de 80%, 50%, de saccharose 20% (p / v) dans du PBS pH 7,4 (10 ml de chaque). </li><li> Préparer le gradient de saccharose dans un tube Falcon de 15 ml à partir de 2 ml de saccharose à 80%, puis 50% et 20%. Verser lentement la pente et faire attention à ne pas déranger les couches déjà versé. Le lysat digéré couche au-dessus de la pente et centrifuger pendant 15 min à 1000 xg à 4 ° C. </li><li> Recueillir soigneusement l&#39;interphase entre la couche de saccharose 50-80% avec une pipette et mélanger avec 5 volumes de PBS pH 7,4. Centrifuger pendant 15 minutes à 1000 xg à 4 ° C. Répétez laver deux fois de plus. Dans cette interphase, aggresomes sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous lumière UV. </li><li> Jeter le surnageant etremettre en suspension le culot dans du PBS pH 250-500 ul 7.4. Ce culot contient le aggresomes purifiée (Figure 2). </li></ol> 3. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Graine 5 x 10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. SH-SY5Y cellules sont cultivées dans un milieu supplémenté avec DMEM/F-12 pénicilline / streptomycine, non-acides aminés essentiels (AANE) et 10% de FBS. </li><li> 24 heures plus tard, ajouter 10 ul à chaque puits et incuber pendant 48-72 h. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et éteindre la fluorescence extracellulaire avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. </li><li> Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). </li><li> Confirmer l&#39;absorption /invasion de manière exogène aggresomes appliquées par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images. </li></ol> Pourtant, l&#39;adoption / l&#39;invasion de la protéine exogène peut ne pas être détecté essentiellement en parallèle avec le recrutement de protéine de cellule hôte. Dans notre exemple mRFP-étiqueté DISC1 aggresomes recrue soluble GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 3). Les photos ont été prises sur une confocal Zeiss LSM 510 ou un microscope Zeiss AxioVision Apotome2. 4. Génération de DISC1 recombinant (598-785) Dans une publication précédente, nous avons analysé la capacité de divers fragments de protéine DISC1 à l&#39;auto-interaction basée sur la présence d&#39;auto-association domaines. Parmi toutes les protéines humaines fragments testés DISC1 (598-785) affiché la plus forte propension à la multimérisation 4 (figure 4). Par conséquent, l&#39;homme DISC1 (598-785) a été cloné dans pET15b (Nonvagen, Madison, Wisconsin) contenant un tag 6-histidine N-terminale, exprimé dans E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, États-Unis), et purifiée dans des conditions dénaturantes à 8 mol / l d&#39;urée, comme décrit 4. En bref, le protocole est décrit ci-dessous. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli ont été cultivées dans 2 x 500 ml 2YT contenant 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol jusqu&#39;à une DO 600: 0.6-0.8 et DISC1 (598-785) l&#39;expression a été induite avec 1 mM d&#39;IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) a été exprimé pendant 4 heures à 37 ° C, l&#39;expression a pris fin en récoltant les bactéries par centrifugation. </li><li> Le culot bactérien est remis en suspension dans 50 ml de tampon TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) et 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml DNase I. Pour assurer une lyse complète, la réaction a été incubée pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Ajouter 10 mM β-mercaptooethanol (ME) et 500 mM de NaCl et incuber pendant 30 min supplémentaires. </li><li> Isoler des corps d&#39;inclusion bactériens à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Resuspendre le culot dans 50 ml de tampon d&#39;extraction contenant 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM β-ME et enlever les débris par centrifugation à 20,000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver le Ni-NTA agarose matrice avec un tampon d&#39;extraction. Incuber la suspension d&#39;, extrait de protéine précontrôlés avec matrice Ni-NTA pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver la matrice Ni-NTA avec un tampon d&#39;extraction contenant 12 mM d&#39;imidazole. </li><li> Éluer la protéine lentement avec 15 ml de tampon d&#39;élution contenant 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM d&#39;imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, 5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de β-ME. </li><li> Dialyser la protéine par étapes pour PBS pH 7,4 contenant 10 mM de β-ME. </li></ol> De 1 L de culture bactérienne de départ, il est possible d&#39;isoler jusqu&#39;à 50 mg de recombinaison DISC1 (598-785) protein. α-synucléine repliement Pour les expériences avec α-synucléine, 500 ug de la protéine recombinante (Sigma-Aldrich, USA) a été dissous dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml. Pour obtenir des oligomères, repliement a été effectuée durant la nuit à 37 ° C comme décrit dans une publication précédente 10. 5. L&#39;étiquetage des DISC1 recombinant (598-785) avec DyLight594 <ol><li> Avant le processus de repérage ultérieur, DISC1 (598-785) protéine a être libéré de la β-ME. Par conséquent, la protéine est dialysée 3 fois au PBS pH 7,4 à une dilution de 1:2000. </li><li> Étiquette 1 mg DISC1 (598-785) avec DyLight 594 maléimide (Thermo Scientific, USA) selon les instructions du fabricant. En bref, dissoudre 1 mg / ml de protéine dans du PBS pH 7,4 et ajouter 5 PTCE mM de récupérer des groupes thiols libres. Ajouter 20 ul du colorant DMF dissous à la réaction et incuber pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Dialyser la protéine 3 x à PBS pH7,4 dans un rapport de 1:2000 à 2 heures chacune. </li></ol> Pour augmenter encore la pureté de la protéine marquée d&#39;une étiquette 6-Son affinité basée sur la purification sur une colonne de Ni-NTA est effectuée. <ol start="4"><li> Lavez 1 ml matrice Ni-NTA (Qiagen, Allemagne) avec 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Appliquer l&#39;étiquette, protéine dialysée à la colonne et le laisser tourner au-dessus de la colonne lentement. </li><li> Laver la protéine avec 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Éluer la protéine avec du PBS pH 7,4, 500 mM d&#39;imidazole, goutte à goutte, tout en surveillant la bande de couleur sur la colonne Ni-NTA à réduire le volume de l&#39;éluat. </li><li> Dialyser l&#39;éluat de 3 x à 10 mM NaPi pH 7,4 à une dilution de 1:2000 pendant 2 heures chacune. </li><li> Utiliser une seringue stérile 0,45 um filtre pour filtrer l&#39;éluat, aliquote de 5 x 100 pi des échantillons et congeler pression dans l&#39;azote liquide. Le montant total des protéines doit être de 0,5 à 1 mg / ml dans chaque aliquote de 100 ul. </li></ol> option concentrtion étape <ol start="10"><li> Pour les injections stéréotaxiques rat, la protéine a été concentrée 10 fois dans un speed-vac (Concentrateur Eppendorf 5301). L&#39;état tampon final était de 100 NaPi mM. </li></ol> α-synucléine étiquetage Le marquage et de purification (colonne Ni-NTA) de la α-synucléine recombinante a été réalisée en parallèle à DISC1 (598-785). Le total du matériau de départ était 500 pg au lieu de 1 mg pour DISC1 (598-785). 6. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec marqué DISC1 recombinant (598-785) Protéine <ol><li> Semences 5x10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. </li><li> Ajouter protéine marquée au milieu de culture cellulaire à une concentration de 5-10 pg / ml et incuber pendant 48-72 h. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et étancher extractionfluorescence ellular avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. </li><li> Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). </li><li> Confirmer l&#39;adoption / l&#39;invasion de manière exogène appliquée protéine recombinante par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images générées par microscopie confocale à balayage laser. Pourtant, le recrutement de protéine endogène peut pas être détectée essentiellement en parallèle avec l&#39;invasion de protéine de cellule hôte, Z-stack images peut encore confirmer le caractère invasif de la protéine. </li></ol> Dans notre exemple, rec. DISC1 (598-785) * au moins en partie soluble recrues GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 5A). Pour recombinant invasion α-synucléine, mais aucun recrutement est montré (figure 5B). Les photos ont été prisessur un Zeiss LSM 510 confocal Zeiss ou un microscope AxioVision Apotome2. L&#39;injection du concentré (environ 4 pi de 2,5 pg / pl), étiqueté DISC1 (598-785) * dans les résultats Mpfc dans la diffusion de la protéine autour du site d&#39;injection qui peut être détecté même après la perfusion de l&#39;animal avec 4% dans du PBS pH 7,4 PFA avec un filterset rhodamine. Dans notre exemple DISC1 (598-785) est repris par un nombre distinct de neurones et peut être contrôlé avec Z-stack d&#39;imagerie (figure 6). En général, l&#39;injection de protéines autres que celles utilisées ici ne conduisent pas nécessairement à la cellule-invasion. L&#39;événement invasion dépend essentiellement de la nature de la protéine néanmoins une purification propre est une condition préalable à une analyse plus approfondie. 7. Les résultats représentatifs Aggresomes consistant recombinant FL DISC1-eGFP purifiée à partir de cellules du FLN a envahi destinataire SH-SY5Y CElls à faible rendement (environ 0,3% 5) comme on le voit par la colocalisation en microscopie confocale (figure 3). Comme indiqué précédemment, DISC1 (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli formée multimères 4 sont également des cellules invasives dans un rendement d&#39;environ 20% 5 (figure 5A) similaire à celui de α-synucléine qui a été utilisé en parallèle comme contrôle positif (figure 5B). Étiquetés DISC1 recombinant (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli a également été cellulaire invasive pour les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été stéréotaxique injecté dans le cortex médial préfrontal de rat (figure 6; Pum, Bader, Huston, Korth, non publié). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cellules de neuroblastome FNL exprimant de manière transitoire FP-DISC1 (rouge). Red aggresomes fluorescents peuvent être detela Direction exécutive dans les cellules. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Purifiée mRFP-marqué DISC1 aggresomes après la purification dans un gradient de saccharose. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fluorescent image de aggresomes envahies. mRFP-étiquette flDISC1 aggresomes ont été purifiées et incubées avec des cellules de neuroblastome SH-SY5Y surexprimant GFP soluble étiquetée DISC1 (598-854). Un apport de aggresomes étiquetés est contrôlée par Z-stack imagerie sur un microscope à balayage laser (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. SEC profil de rec. DISC1 (598-785) contenant le S704 et C704 les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP). Les deux variantes montrent une perturbation d&#39;oligomérisation commandé et la formation de mult haut poids moléculaireIMERS (flèche rouge). Cette image est modifié à partir de la publication de Leliveld et al., Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Fluorescent Z-stack image de DyLight marqué invasive DISC1 recombinant (598-785). Les cellules de neuroblastome SH-SY5Y exprimant la GFP-DISC1 soluble (598-854) ont été incubées avec étiquette, la protéine recombinante à une concentration de 5 pg / ml. (A) des agrégats Rouge montre l&#39;invasion de rec. DISC1 (598-785) des protéines et des points jaunes indiquent un recrutement de GFP-DISC1 soluble (598-854) en agrégats. (B) recombinante α-synucléine (rouge) envahit les cellules sans recrutement avec une fréquence d&#39;environ 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Image immunofluorescence del&#39;injection marqué, DISC1 recombinant (598-785) de protéine. Z-stack imagerie confirme la présence de rec. DISC1 (598-785) des protéines dans les neurones corticaux de rat tachés avec un anticorps contre les noyaux des neurones (NeuN, vert).

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous décrivons la purification de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes à partir d&#39;une lignée cellulaire de neuroblastome transfectée, la préparation et l&#39;étiquetage d&#39;un DISC1 espèces de protéines recombinantes et leur application dans la cellule à l&#39;invasion de cellules réceptrices des expériences in vitro et in vivo. La purification des indigènes mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a été développé à partir de protocoles d&#39;isoler le corps de Lewy-comme les structures et les grands agrégats 13, 14, mais modifié pour éviter l&#39;utilisation de détergents et de minimiser le risque de faux positif cellulaire invasion qui pourrait se produire due à la pénétration de la membrane détergent facilitée. Une amélioration future possible pourrait être la pour augmenter encore la pureté des aggresomes par sonication de séparer complètement les membranes restantes et du cytosquelette des aggresomes. Par la pureté générale à la hausse, le nombre d&#39;événements d&#39;invasion totale à celui enregistré pour les grandes aggresomes may être augmenté de 5. Que la définition limitée de notre suggère 3-phase de saccharose est suffisante pour aggresomes d&#39;espèces autres protéines doit être testé, en ce sens, le protocole décrit ici doit être considérée comme un point de départ pour l&#39;optimisation individuelle. Les aggresomes purifiés s&#39;est avéré très robuste dans nos mains, les étapes de lavage supplémentaires (sans détergent) pour éliminer les traces de saccharose n&#39;a pas réduit significativement le rendement global. Dans une publication précédente, nous avons décrit cette assemblée oligomère de DISC1 dépend domaines de multimérisation distinctes dans l&#39;extrémité C-terminale 4 (figure 4). Nous avons choisi ce fragment pour l&#39;expression recombinante soluble dans E. coli et ultérieures et Ni-NTA purification. Pour surveiller son multimérisation et de comparer son caractère invasif de cellules avec un cellulaire invasive décrite comme la protéine α-synucléine, nous avons appelé DISC1 (598-785) avec le colorant fluorescent DyLight594, et ont comparé soncellules envahissant avec celle de tout aussi marqué α-synucléine. La cellule-invasif de la recombinaison DISC1 fragment a été considérablement augmenté par rapport à celui des indigènes, pleine longueur DISC1 aggresomes, probablement en raison de sa petite taille et la pureté beaucoup plus élevé. Encore une fois, la pureté semble jouer un rôle décisif dans la cellule-invasif. Dans notre exemple, les aggresomes invasives recruté protéine homologue soluble de la lignée cellulaire cible qui a été exprimée sous forme recombinante soluble dans un, c&#39;est à dire des cellules sous forme dispersée. L&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente (GFP ou RFP, par exemple) dans la ligne de cellule receveuse est un avantage, car il permet la co-localisation de aggresomes invasives et de protéines recombinantes à l&#39;intérieur de la limite de cellule receveuse par Z-pile imagerie. Aggresomes DISC1 cellules invasives et des fragments multimères exprimée et purifiée à partir de E. coli pourrait être un élément déterminant de la protéine de conformation d&#39;une des maladies liées à DISC1, DISC1opathies 15. Inconvénients et remèdes: Faible rendement aggresome après purification sur gradient de saccharose: Le gradient de saccharose introduit dans ce protocole fonctionne bien avec eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes comprenant d&#39;autres protéines peuvent être de dimensions variables par conséquent, les concentrations en saccharose doit être optimisée par d&#39;autres utilisateurs. Purification insuffisante de protéines recombinantes: Des contaminants bactériens dans le procédé de purification de la protéine recombinante est également marqué dans les étapes ultérieures du protocole. Pour éviter les contaminations, exécutez la protéine sur une SDS-PAGE et confirmer que la protéine recombinante est d&#39;au moins 95% de pureté par coloration de Coomassie-Bleu. Pour assurer la meilleure qualité et le rendement, le protocole doit être optimisée pour chaque protéine individuelle. Faible étiquetage efcacité de protéines recombinantes: Des contaminations qui contiennent les groupes SH libres diminue marquage efficace de la protéine. Par conséquent, une dialyse extensive et Ni-NTA de purification à base est obligatoire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Milieu est fonction de la lignée cellulaire hôte. La ligne du destinataire optimale cellule doit être déterminée par l&#39;utilisateur. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Milieu est fonction de la ligne de cellule receveuse. La ligne du destinataire optimale cellule doit être déterminée par l&#39;utilisateur. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> D&#39;autres réactifs de transfection pourrait fonctionner aussi bien mais n&#39;ont pas été testés avec notre protocole. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Les expériences ont été faites avec Ni_NTA agarose de Qiagen, d&#39;autres fournisseurs devrait fonctionner aussi bien. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Il n&#39;est pas nécessaire de DNase RNase dans le processus de purification aggresomes. </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Milieu sans sérum fonctionne aussi bien </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Supplément pour SH-SY5Y et moyennes NLF </td></tr><tr><td> Non essentielle-amino-acides (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Supplément pour SH-SY5Y moyen </td></tr><tr><td> Bleu trypan 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Réactif toxique </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Réduction de colorant réactif cystéine pour former des liaisons thioéther stables. Egalement disponible dans d&#39;autres couleurs. </td></tr><tr><td> ProLong or avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Ce milieu de montage liquide antifade a donné des résultats supérieurs à nos mains. </td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de la protéase </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Dissoudre 1 table dans 500 pl H 2 O pour solution 100X. </td></tr><tr><td> Synthétique a-synucléine </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Replier comme décrit dans le texte. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Table de réactifs spécifiques. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Nous n&#39;avons pas testé les autres homo mécaniquenizers autres que cela. Autre méthode d&#39;homogénéisation sans détergent pourrait fonctionner aussi bien, mais n&#39;ont pas été testés pour ce protocole. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrateur (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Uniquement nécessaire si la protéine doit être concentré. </td></tr><tr><td> LSM 510 et AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Consultez le catalogue des fabricants </td><td> Les deux microscopes abriter la possibilité d&#39;effectuer Z-stack imagerie. Il s&#39;agit d&#39;une condition préalable pour l&#39;évaluation solide et sérieuse des événements d&#39;invasion. </td></tr><tr><td> Matière plastique de culture cellulaire </td><td> Nunc </td><td> Boîtes de 10 cm # 172958, plaques à 24 puits # 142475 </td><td> L&#39;utilisation d&#39;une matière plastique différente pourrait influencer l&#39;interaction de protéines recombinantes ou aggresomes et les surfaces en plastique. Nous n&#39;avons pas testé d&#39;autres matériaux que ceux décrits ici. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Table des matières spécifiques et des équipements. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Nom du tampon </td><td> teneur </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Milieu de croissance bactérienne </td><td> 16 g / l de Bacto Tryptone, 10 g / l d&#39;extrait de levure Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol </td><td> Cultiver des bactéries à DO 600: 0.6-0.8 induire l&#39;expression avec 1 mM d&#39;IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampon de resuspension bactérienne </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 5 mM, 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml de DNase I </td><td> Resupend culot bactérien de 1 L overnight culture dans 50 ml de tampon de remise en suspension. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampon d&#39;extraction des protéines </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA colonne de tampon de lavage </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM b-ME, 12 mM imidazole </td><td> Tampon d&#39;extraction de modification avec 12 mM d&#39;imidazole ajouté. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA tampon d&#39;élution colonne </td><td> Tris 50 mM, NaCl 500 mM, 300 mM imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, EDTA 5 mM et 10 mM de b-ME </td><td> Le tampon d&#39;élution contient 10 mM b-ME, qui est dialysée par la suite. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l de NaCl, 0,2 g / l de KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l de KH 2 PO 4, ajuster le pH à 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Étiquetage tampon </td><td> PBS contenant 5 mM PTCE </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Table des recettes. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

L&#39;agrégation des protéines est considérée comme une caractéristique générale des affections chroniques dégénératives du cerveau comme, par exemple, dans les maladies neurodégénératives maladie d&#39;Alzheimer (Aß, tau), la maladie de Parkinson (α-synucléine), la maladie de Huntington (polyglutamine, la huntingtine), et d&#39;autres. L&#39;agrégation des protéines est supposée se produire en raison de protéostasie perturbé, c&#39;est à dire le déséquilibre entre l&#39;apparition et la dégradation des protéines mal repliées. Fait à noter, ces mêmes protéines agrégées trouvé dans les formes sporadiques de ces maladies qui sont mutant dans des variantes rares formes familiales. La schizophrénie est une maladie cérébrale chronique progressive qui dans de nombreux cas va de pair avec un déficit cognitif permanent et irréversible. Dans une approche gène candidat, nous avons examiné si Disrupted en schizophrénie 1 (DISC1), un gène cloné dans une famille écossaise avec une liaison à une maladie mentale chronique 1, 2, n&#39;a pu être trouvée sous forme d&#39;agrégats insolubles dans le brain des cas sporadiques de schizophrénie 3. Utilisation du CC SMRI, nous avons identifié chez environ 20% des cas avec CMD mais pas des contrôles normaux ou des patients atteints de maladies neurodégénératives immunoréactivité DISC1 sarkosyl insoluble dans l&#39;après fractionnement biochimique. Des études ultérieures ont révélé in vitro que la propension agrégation des DISC1 a été influencé par la maladie associée au polymorphisme S704C 4, et que DISC1 aggresomes générées in vitro étaient cellulaire invasive 5, similaire à ce qui avait été montré pour Aß 6, tau 7-9, α -synucléine 10, polyglutamine 11 ou SOD1 agrégats 12. Ces résultats nous ont incités à proposer au moins un sous-ensemble des cas de CMD, ceux qui DISC1 agrégée peut-être des troubles de protéines de conformation. Ici, nous décrivons comment nous générons DISC1 aggresomes dans les cellules de mammifères, les purifier sur un gradient de saccharose et de les utiliser pour la cellule-invasif studies. De même, nous décrivons comment nous générons une exclusivité multimérique C-terminale DISC1 fragment, l&#39;étiquette et le purifier pour les études invasif des cellules. Utilisation des multimères recombinés de DISC1 nous atteignons invasion cellulaire similaire à celle d&#39;une dénomination semblable synthétique α-synucléine fragment. Nous montrons également que ce fragment est repris in vivo lorsque stéréotaxique injecté dans le cerveau des animaux receveurs.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

L&#39;invasion de la génération, de la purification et de la cellule de cytoplasmiques intracellulaires, aggresomes protéine pleine longueur DISC1 de cultures de cellules et d&#39;une étiquette, multimérique recombinante DISC1 fragment de protéine dans<em&gt; E. coli</em&gt; Sont décrits. Invasivité de cellules est indiquée pour les cellules réceptrices en culture cellulaire et pour les neurones<em&gt; In vivo</em&gt; Après l&#39;inoculation stéréotaxique du cerveau.

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