Name: generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00
Duration: 14 min 33 s
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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस अध्ययन में हम एक ट्रांसफ़ेक्ट neuroblastoma सेल लाइन, तैयारी और एक रीकॉम्बीनैंट DISC1 प्रोटीन प्रजातियों की लेबलिंग और इन विट्रो में और vivo में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के सेल आक्रमण प्रयोगों में उनके आवेदन से mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes की शुद्धि का वर्णन करता है. देशी mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes की शुद्धि प्रोटोकॉल से विकसित किया गया था Lewy शरीर संरचनाओं की तरह और बड़े समुच्चय 13, 14 को अलग करने के लिए, लेकिन डिटर्जेंट के उपयोग से बचने के लिए और झूठी सकारात्मक सेल आक्रमण का खतरा है कि हो सकता है कम से कम करने के लिए संशोधित डिटर्जेंट सुगम बनाया झिल्ली प्रवेश करने के लिए कारण. एक संभव भविष्य में सुधार के लिए आगे aggresomes से पूरी तरह से अलग शेष झिल्ली और cytoskeleton sonication द्वारा aggresomes की शुद्धता को बढ़ाने में हो सकता है. बढ़ती समग्र पवित्रता, कुल आक्रमण घटनाओं की संख्या है कि बड़े aggresomes माँ के लिए दर्जy 5 वृद्धि हुई है. क्या हमारे सुझाए sucrose 3-चरण की सीमित परिभाषा अन्य प्रोटीन प्रजाति के aggresomes के लिए पर्याप्त है के लिए परीक्षण किया जा सकता है, इस अर्थ में प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित व्यक्तिगत अनुकूलन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में माना जाना चाहिए. शुद्ध aggresomes हमारे हाथ, अतिरिक्त धोने कदम (डिटर्जेंट) के बिना कुल उपज काफी कम sucrose के निशान को खत्म करने में काफी मजबूत साबित हुई. हम पिछले एक प्रकाशन में वर्णित है कि DISC1 की oligomer विधानसभा 4 सी टर्मिनस (4 चित्रा) में अलग multimerization डोमेन पर निर्भर है. हम ई. में पुनः संयोजक घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए इस टुकड़ा चुना कोलाई और बाद में और नी NTA शुद्धि. अपने multimerization की निगरानी करने और α-synuclein प्रोटीन कोशिका की तरह आक्रामक के साथ अपने सेल invasiveness की तुलना करने के लिए, हम साथ फ्लोरोसेंट डाई DyLight594 DISC1 (598-785) लेबल, और की तुलना में अपनीसमान रूप से लेबल α synuclein का उस के साथ सेल invasiveness. रीकॉम्बीनैंट DISC1 टुकड़ा की सेल invasiveness देशी, पूर्ण DISC1 aggresomes लंबाई, अपने छोटे आकार और बहुत उच्च शुद्धता के कारण होने की संभावना की है कि तुलना में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई थी. फिर, शुद्धता के लिए सेल invasiveness में एक निर्णायक भूमिका निभा रहा है. हमारे उदाहरण में आक्रामक aggresomes लक्ष्य सेल लाइन के घुलनशील सजात प्रोटीन है कि recombinantly एक घुलनशील, यानी फार्म सेल छितरी हुई में व्यक्त किया गया था भर्ती किया था. प्राप्तकर्ता सेल लाइन में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP या आरएफपी) की अभिव्यक्ति एक फायदा है क्योंकि यह प्राप्तकर्ता सेल सीमा के भीतर आक्रामक aggresomes और पुनः संयोजक प्रोटीन के Z-ढेर इमेजिंग के माध्यम से colocalization की अनुमति देता है. सेल इनवेसिव DISC1 aggresomes और multimeric टुकड़े व्यक्त की और ई. से शुद्ध कोलाई एक प्रोटीन गठनात्मक DISC1, डि से संबंधित रोगों की एक विशेषता परिभाषित किया जा सकता है15 SC1opathies. मुसीबत शूटिंग: Sucrose ढाल शुद्धि के बाद कम aggresome उपज: sucrose इस प्रोटोकॉल में शुरू ढाल eGFP/mRFP-DISC1 aggresomes (FL) के साथ अच्छी तरह से काम करता है. अन्य प्रोटीन से मिलकर Aggresomes चर आयामों की हो इसलिए sucrose सांद्रता अन्य उपयोगकर्ताओं के द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए सकता है. पुनः संयोजक प्रोटीन की अपर्याप्त शुद्धिकरण: पुनः संयोजक प्रोटीन की शोधन प्रक्रिया में किसी भी बैक्टीरिया contaminants भी प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में लेबल किया जाएगा. Contaminations से बचने के लिए, एक एसडीएस पृष्ठ पर प्रोटीन को चलाने के लिए और पुष्टि करते हैं कि प्रोटीन रीकॉम्बीनैंट Coomassie ब्लू के साथ धुंधला करके कम से कम 95% है शुद्ध. उच्चतम गुणवत्ता और उपज सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल के लिए प्रत्येक व्यक्ति के प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है. कम लेबलिंग एफईपुनः संयोजक प्रोटीन की ficiency: कोई contaminations है कि मुक्त एसएच समूहों शामिल प्रोटीन की कुशल लेबलिंग में कमी होगी. इसलिए, व्यापक डायलिसिस और नी NTA आधारित शुद्धि अनिवार्य है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक नाम </td><td> कंपनी </td><td> कैटलॉग संख्या </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> 1640 RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> मध्यम मेजबान सेल लाइन पर निर्भर है. इष्टतम प्राप्तकर्ता सेल लाइन उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> मध्यम प्राप्तकर्ता सेल लाइन पर निर्भर है. इष्टतम प्राप्तकर्ता सेल लाइन उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. </td></tr><tr><td> पीबीएस </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> अन्य अभिकर्मक अभिकर्मकों के रूप में अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किया गया नहीं हो सकता है. </td></tr><tr><td> नी NTA agarose </td><td> क्विएज़न </td><td> 30210 &lt;/ P&gt; <td> प्रयोगों Qiagen से Ni_NTA agarose के साथ किया गया था, अन्य आपूर्तिकर्ताओं के रूप में अच्छी तरह से काम करना चाहिए. </td></tr><tr><td> DNase मैं </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> RNase मुक्त DNase के लिए aggresomes शुद्धि की प्रक्रिया में कोई जरूरत नहीं है. </td></tr><tr><td> इक्षुशर्करा </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-सदस्य </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> सीरम मुक्त माध्यम के रूप में अच्छी तरह से काम करता है </td></tr><tr><td> पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन / </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> एसएच SY5Y और NLF मध्यम के लिए अनुपूरक </td></tr><tr><td> गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> M7145 </td><td> एसएच SY5Y मध्यम के लिए अनुपूरक </td></tr><tr><td> Trypan ब्लू 0.4% </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> T8154 </td><td> विषाक्त अभिकर्मक </td></tr><tr><td> DyLight 594 माleimide </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> 46608 </td><td> सिस्टीन प्रतिक्रियाशील डाई कम स्थिर thioether बांड फार्म. इसके अलावा अन्य रंगों में उपलब्ध है. </td></tr><tr><td> DAPI साथ गोल्ड लम्बा </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> इस antifade तरल mountant हमारे हाथ में बेहतर परिणाम दे दी है. </td></tr><tr><td> Protease अवरोध कॉकटेल </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> 500 μl एच 2 हे में 100X समाधान के लिए 1 टेबल भंग. </td></tr><tr><td> सिंथेटिक एक synuclein </td><td> सिग्मा </td><td> S7820 </td><td> Refold रूप में पाठ में वर्णित है. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका. </td></tr><tr><td> 24 Precellys </td><td> Bertin टेक्नोलॉजीज </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> हम अन्य यांत्रिक homoge परीक्षण नहीं किया हैइस के अलावा अन्य nizers. अन्य डिटर्जेंट मुक्त homogenization विधि के रूप में अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन हो सकता है इस प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण किया गया है. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> केवल आवश्यक अगर प्रोटीन के लिए ध्यान केंद्रित किया जाना है. </td></tr><tr><td> LSM 510 और AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> निर्माताओं सूची देखें </td><td> दोनों सूक्ष्मदर्शी Z-ढेर इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता के बंदरगाह. यह आक्रमण की घटनाओं का ठोस और गंभीर मूल्यांकन के लिए एक शर्त है. </td></tr><tr><td> सेल संस्कृति प्लास्टिक सामग्री </td><td> Nunc </td><td> 10 सेमी 172958 # व्यंजन, 24-अच्छी तरह प्लेटें 142475 # </td><td> अलग प्लास्टिक सामग्री के उपयोग के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन या aggresomes और प्लास्टिक की सतहों की बातचीत प्रभावित हो सकता है. हम यहाँ वर्णित लोगों की तुलना में अन्य सामग्री के परीक्षण नहीं किया है. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> विशिष्ट सामग्री और उपकरणों की टेबल. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> संख्या </td><td> बफर नाम </td><td> सामग्री </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> 1. </td><td> बैक्टीरियल मध्यम विकास </td><td> 16 एल / छ Bacto Tryptone, 10 एल / छ Bacto खमीर निकालने, 5 एल / छ NaCl, 5 मिमी arginine - एचसीएल, 5mm MgSO4, 100 छ / मिलीलीटर carbencillin, 35 ग्राम / मिलीलीटर chloramphenicol </td><td> 600 आयुध डिपो में बैक्टीरिया बढ़ने: 0.6-0.8 1 मिमी IPTG के साथ अभिव्यक्ति को प्रेरित. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> बैक्टीरियल resuspension बफर </td><td> 50 मिमी Tris - एचसीएल 8.0 पीएच, 5 मिमी EDTA, 2 मिमी PMSF, 1% TX-100, 250 छ / मिलीलीटर lysozyme, 20 मिमी MgCl 2 और 400 मिलीलीटर U/50 मैं DNase </td><td> 1 एल से बैक्टीरिया लिए गोली Resupend oveमें rnight संस्कृति 50 मिलीलीटर resuspension बफर. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> प्रोटीन निष्कर्षण बफर </td><td> 50 मिमी Tris 8.0 पीएच, 5 मिमी imidazole, 500 मिमी NaCl, 8 एम यूरिया और 10 मिमी बॉल्ड ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> नी NTA स्तंभ धोने बफर </td><td> 50 मिमी Tris 8.0 पीएच, 5 मिमी imidazole, 500 मिमी NaCl, 8 एम यूरिया और 10 मिमी ख ME, 12 मिमी imidazole </td><td> 12 मिमी imidazole के साथ संशोधित निष्कर्षण बफर जोड़ा. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> नी NTA स्तंभ क्षालन बफर </td><td> 50 मिमी Tris, 500 मिमी NaCl, 300 मिमी imidazole, 8 एम यूरिया, 1 मिमी PMSF, 5 मिमी EDTA और 10 मिमी बॉल्ड ME </td><td> क्षालन बफर 10 मिमी ख ME, जो बाद dialyzed है शामिल हैं. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> पीबीएस </td><td> 8 ग्राम / एल NaCl, 0.2 एल / छ KCl, 1.44 एल / छ ना 2 HPO 4, 0.24 एल / छ KH 2 पीओ 4, 7.4 पीएच समायोजित </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> बफर लेबल </td><td> पीबीएस 5 मिमी TCEP युक्त </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> व्यंजनों की तालिका. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

intracellular, cytoplasmic पूर्ण सेल संस्कृतियों से लंबाई DISC1 प्रोटीन aggresomes और एक लेबल, multimeric रीकॉम्बीनैंट DISC1 प्रोटीन में टुकड़ा के उत्पादन, शोधन, और सेल आक्रमण<em&gt; ई. कोलाई</em&gt; वर्णित हैं. सेल invasiveness प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के लिए सेल संस्कृति में और न्यूरॉन्स के लिए दिखाया गया है<em&gt; Vivo में</em&gt; Stereotactical मस्तिष्क टीका के बाद.

जनरेशन, शोधन, सेल इनवेसिव DISC1 प्रोटीन प्रजाति की विशेषता और

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

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