Name: generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Neuron-Eranet oppdage (BMBF 01EW1003) til CK og JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CKVB er støttet av en bevilgning på Forschungskommission av Det medisinske fakultet ved Universitetet i Düsseldorf.

1. Utarbeidelse av Aggresome Donor Cells: Transfeksjon monomere Red fluorescerende protein (mRFP) eller Enhanced grønt fluorescerende protein (eGFP)-merket Humant full lengde (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1.5 x 10 6/10 cm parabol menneskelig neuroblastom NLF (NLF, Children Hospital of Philadelphia, Philadelphia, Pennsylvania) celler i ti 10 cm retter og vokse over natten. NLF celler dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS, penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Neste dag, bør cellene være på 70-80% sammenflyting. </li><li> Forbigående transfektere hver 10 cm tallerken med 15 mikrogram plasmid DNA og Metafectene transfeksjon reagens (Biontex, Martinsried, Tyskland). I korthet, for en 10 cm parabol, ble 15 ug plasmid-DNA og 30 pl tilsatt til Metafectene 750 pl Opti-MEM, blandet og inkubert ved RT i 20 min. 5 retter ble tilført pcDNA3.1 mRFP / eGFP-merket Human (FL) Disc1 og 5 retter med eGFP-plasmid alene. </li></ol> 2. AggresomeRensing fra transfekterte Donor Cells Protokollen er beskrevet her er en kombinasjon av en fremgangsmåte for å rense Lewy-organer fra hjernevev 13 og en protokoll for å isolere store aggregater og aggresomes 14. Siden allerede eksisterende metoder er basert på bruken av vaskemidler, isolering av vaskemiddel-fri protein for anvendelse i celle-invasivitet analysene er kritisk. <ol><li> 48 hr etter transfeksjon, overvåke ekspresjon av eGFP og mRFP/eGFP-DISC1 og bekrefte dannelsen av aggresomes under et fluorescensmikroskop (Figur 1). </li><li> Vask cellene med PBS pH 7,4, skrape med 400 pl PBS hver, legge 1X Protease Inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN) og forstyrre cellene ved hjelp av en Precellys24 homogenisator (Bertin Technologies, Frankrike). Kort, tilsett 1 ml cellesuspensjon til en 2 ml lysis rør og tilsett 10 keramiske perler. Lysere cellene med 3 x 60 sek pulser. Den mekaniske kraft-prosessen kanøke temperaturen i prøven over 37 ° C slik at forsiktighet bør tas til chill prøven på isen etter lysis prosedyren. </li><li> Avkjøl cellene på is og tilsett 10 mM 2 MgCl, 40 U / ml DNase A og inkuber i 60 min ved 37 ° C </li><li> Forbered løsninger av 80%, 50%, 20% sukrose (vekt / volum) i PBS pH 7,4 (10 ml hver gang). </li><li> Klargjør sukrosegradient i et 15 ml falk tube, som starter med 2 ml 80% sukrose, etterfulgt av 50% og 20%. Hell gradient langsomt og være forsiktig for ikke å forstyrre allerede strømmet lag. Lag fordøyd lysatet på toppen av gradienten og sentrifuger i 15 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C. </li><li> Nøye samle interfase mellom 50-80% sukrose laget med en pipette og bland med 5 volumdeler PBS pH 7,4. Sentrifuger i 15 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C. Gjenta vaske ytterligere to ganger. I denne interfase, aggresomes er fluorescerende og kan visualiseres i et mikroskop under UV lys. </li><li> Kast supernatanten ogresuspender pelleten i 250-500 pl PBS pH 7,4. En slik pellet inneholder rensede aggresomes (figur 2). </li></ol> 3. Behandling av Mottaker SH-SY5Y Cells med mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Seed 5 x 10 4 mottaker SH-SY5Y humane neuroblastom celler konstitutivt uttrykker GFP-DISC1 (598-854) på sterile glass dekkglass i hver brønn av en 24 brønns plate. SH-SY5Y celle dyrkes i DMEM/F-12 medium supplert med penicillin / streptomycin, ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) og 10% FBS. </li><li> 24 hr senere, tilsett 10 pl til hver brønn og inkuberes i 48 til 72 timer. </li><li> Vask cellene 3 x med PBS pH 7,4 og slukke ekstracellulær fluorescens med 0,04% Trypan Blue for 5 min. </li><li> Fikser cellene med 4% PFA i PBS pH 7,4 i 10 min på is, vaskes én gang med sterilt H2O og montere dekkglass på glassplater med forlenge Gull med DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA). </li><li> Bekreft opptak /invasjon av eksogent anvendt aggresomes av colocalization med rekruttert proteiner uttrykt av mottaker celler i Z-stack bilder. </li></ol> Likevel, kanskje opptak / invasjon av eksogene protein ikke vesentlig bli oppdaget parallelt med rekruttering av vertscellen protein. I vårt eksempel mRFP-merket DISC1 aggresomes rekruttere løselig GFP-merket DISC1 (598-854) protein uttrykt av vertscellen (se figur 3). Bildene ble tatt på en Zeiss LSM 510 confocal-eller Zeiss Axiovision Apotome2 mikroskop. 4. Generasjon av rekombinant DISC1 (598-785) I en tidligere publikasjon analyserte vi muligheten av ulike Disc1 proteinfragmenter til selv-samhandle basert på tilstedeværelsen av selv-forening domener. Blant alle protein fragmenter testet menneskelig DISC1 (598-785) som viste sterkest multimerization tilbøyelighet 4 (figur 4). Derfor ble menneske DISC1 (598-785) klonet inn pET15b (NoVågen, Madison, Wisconsin) inneholdende et N-terminal 6-histidin tag, uttrykt i E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), og renset i henhold denaturing forhold i 8 mol / l urea som beskrevet fire. Kort sagt, er protokollen som er beskrevet nedenfor. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli ble dyrket i 2 x 500 ml 2YT inneholdende 5 mM-arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol opptil en OD 600: 0,6 til 0,8 og DISC1 (598-785) uttrykk ble indusert med 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) ble uttrykt i 4 timer ved 37 ° C ble uttrykket terminert ved å høste bakteriene ved sentrifugering. </li><li> Den bakterielle pellet ble resuspendert i 50 ml TE-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) pluss 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 pg / ml lysozym, 20 mM MgCl 2 og 400 U/50 ml DNase I. For å sikre fullstendig lysis, ble reaksjonsblandingen inkubert i 30 minutter ved RT med forsiktig omrøring. </li><li> Tilsett 10 mM β-mercaptoethanol (ME) og 500 mM NaCl og inkuber for en annen 30 min. </li><li> Spinne ned bakterielle inklusjonslegemer ved 20,000 g i 30 minutter ved 4 ° C. </li><li> Gjensuspender pellet i 50 ml utvinning buffer inneholdende 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea og 10 mM β-ME og fjerne rusk ved sentrifugering ved 20,000 g i 30 minutter ved 4 ° C. </li><li> Vask Ni-NTA agarose matrise med utvinning buffer. Inkuber resuspenderte, precleared proteinekstrakt med Ni-NTA matrise i 2 timer ved RT. </li><li> Vask Ni-NTA-matrise med utvinning buffer inneholdende 12 mM imidazol. </li><li> Eluer proteinet langsomt med 15 ml elueringsbuffer inneholdende 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA og 10 mM β-ME. </li><li> Dialyser proteinet trinnvis til PBS pH 7,4 inneholdende 10 mM β-ME. </li></ol> Fra 1 L bakteriell start kultur er det mulig å isolere opp til 50 mg rekombinant DISC1 (598-785) ProtEin. α-synuclein refolding For eksperimenter med α-synuclein, 500 ug av det rekombinante protein (Sigma-Aldrich, USA) ble oppløst i PBS ved en konsentrasjon på 1 mg / ml. For å oppnå oligomerer, er refolding utført over natten ved 37 ° C som beskrevet i en tidligere publikasjon 10. 5. Merking av rekombinant DISC1 (598-785) med DyLight594 <ol><li> Før den påfølgende merking prosessen, DISC1 (598-785) protein har bli frigjort fra β-ME. Derfor er proteinet dialysert 3 ganger til PBS pH 7,4 ved en fortynning på 1:2,000. </li><li> Etiketten 1 mg DISC1 (598-785) med DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt, oppløse 1 mg / ml protein i PBS pH 7,4 og tilsett 5 mM TCEP å gjenopprette frie tiolgrupper. Tilsett 20 pl av DMF oppløst fargestoff til reaksjonsblandingen og inkuber i 2 timer ved romtemperatur. </li><li> Dialyser proteinet 3 x til PBS pH7,4 i et forhold på 1:2000 i 2 timer hver. </li></ol> For ytterligere å øke renheten av den merkede protein en sin 6-tagget baserte affinitet-rensing på en Ni-NTA kolonne utføres. <ol start="4"><li> Vask 1 ml Ni-NTA-matrise (Qiagen, Tyskland) med 10 ml PBS pH 7,4. </li><li> Påfør merket, dialyserte protein til kolonnen og la den gå over kolonnen sakte. </li><li> Vask proteinet med 3 x 20 ml PBS pH 7,4 </li><li> Eluer proteinet med PBS pH 7,4, 500 mM imidazol dråpevis mens overvåke farget bånd på Ni-NTA-kolonnen for å redusere eluatet volum. </li><li> Dialyser eluatet 3 x til 10 mM NaPi, pH 7,4 ved en fortynning på 1:2000 i 2 timer hver. </li><li> Bruk en steril 0,45 mikrometer sprøyte filter for å filtrere eluatet, alikvoter i 5 x 100 ul prøver og snap fryse i flytende nitrogen. Den totale mengden av protein bør være 0,5 til 1 pg / ml i hver 100 pl alikvot. </li></ol> valgfri konsentrasjonerasjon trinn <ol start="10"><li> For stereotactical rotte injeksjoner, ble proteinet konsentrert 10-fold i en speed-vac (Eppendorf konsentrator 5301). Den endelige buffer tilstand var 100 mM NaPi. </li></ol> α-synuclein Merking Merking og rensing (Ni-NTA kolonne) av det rekombinante α-synuclein ble utført parallelt med DISC1 (598-785). Den totale utgangsmateriale var 500 ug i stedet for 1 mg for DISC1 (598-785). 6. Behandling av Mottaker SH-SY5Y Cells med Merket Rekombinant DISC1 (598-785) Protein <ol><li> Seed 5x10 4 mottaker SH-SY5Y humane neuroblastom celler konstitutivt uttrykker GFP-DISC1 (598-854) på sterile glass dekkglass i hver brønn av en 24 brønns plate. </li><li> Legg merket protein til cellekulturmediet i en konsentrasjon på 5-10 ug / ml og inkuberes i 48 til 72 timer. </li><li> Vask cellene 3 x med PBS pH 7,4 og slukke utsuellular fluorescens med 0,04% Trypan Blue for 5 min. </li><li> Fikser cellene med 4% PFA i PBS pH 7,4 i 10 min på is, vaskes én gang med sterilt H2O og montere dekkglass på glassplater med forlenge Gull med DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA). </li><li> Bekreft opptak / invasjonen av eksogent påført rekombinant protein av colocalization med rekruttert proteiner uttrykt av mottaker celler i Z-stack bildene som genereres av laserskanning konfokalmikroskopi. Likevel kan rekruttering av endogent protein ikke vesentlig påvises parallelt med invasjon av vertscelle protein, kan Z-stack bildene fortsatt bekrefte invasiv natur av proteinet. </li></ol> I vårt eksempel rec. DISC1 (598-785) * i det minste delvis rekrutter løselig GFP-merket DISC1 (598-854) protein uttrykt av vertscellen (se figur 5A). For rekombinant α-synuclein invasjon men ingen rekruttering vises (fig. 5B). Bildene ble tattpå en Zeiss LSM 510 confocal-eller Zeiss Axiovision Apotome2 mikroskop. Injeksjon av den konsentrerte (ca. 4 pl 2,5 ug / ul), merket DISC1 (598-785) * i mPFC resultater i spredning av proteinet rundt injeksjonsstedet som kan detekteres selv etter perfusjon av dyret med 4% PFA i PBS pH 7,4 med en rhodamin filterset. I vårt eksempel DISC1 (598-785) er tatt opp av en distinkt antall nevroner og kan overvåkes med Z-stack bildebehandling (figur 6). Generelt, gjør injeksjon av proteiner andre da de brukes her ikke nødvendigvis føre til celle-invasjonen. Invasjonen arrangementet er svært avhengig av arten av protein, er likevel en ren rensing en forutsetning for videre analyse. 7. Representant Resultater Aggresomes bestående av rekombinant FL DISC1-eGFP renset fra NLF celler invadert mottaker SH-SY5Y ceLLS ved lav effektivitet (ca 0,3% 5) som sett av colocalization med konfokalmikroskopi (figur 3). Som tidligere rapportert, DISC1 (598-785) uttrykt og renset fra E. coli dannet multimerer 4 var like celle-invasiv ved en effektivitet på ca 20% 5 (figur 5A) lik som α-synuclein som ble brukt i parallell som positiv kontroll (figur 5B). Merket rekombinant DISC1 (598-785) uttrykt og renset fra E. coli var også celle-invasiv til nevroner i vivo når multimeric protein ble stereotactically injiseres i mediale prefrontal cortex av en rotte (figur 6, Pum, Bader, Huston, Korth, upublisert). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. NLF neuroblastom celler forbigående uttrykk FP-DISC1 (rød). Røde fluorescerende aggresomes kan være Detected i cellene. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Renset mRFP-merket Disc1 aggresomes etter rensing i en sukrosegradient. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Fluorescent bilde av invaderte aggresomes. mRFP-merket flDISC1 aggresomes ble renset og inkubert med SH-SY5Y neuroblastom celler overekspresjon løselig GFP-merket DISC1 (598-854). Et opptak av merket aggresomes overvåkes av Z-stack bildebehandling på en Laser-Scan mikroskop (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. SEC-profilen rec. DISC1 (598-785) som inneholder S704 og C704 single nukleotid polymorfismer (SNP). Begge variantene viser en forstyrrelse av bestilte oligomerisering og dannelsen av høy molekylvekt multimers (rød pil). Dette bildet er endret fra og med publiseringen av Leliveld et al., 2009 biokjemi. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. Fluorescent Z-stack bilde av invasiv DyLight-merket rekombinant DISC1 (598-785). SH-SY5Y neuroblastom celler uttrykker oppløselig GFP-DISC1 (598-854) ble inkubert med merket, rekombinant protein ved en konsentrasjon på 5 ug / ml. (A) Red aggregater viser invasjonen av rec. DISC1 (598-785) protein og gule prikkene indikerer en rekruttering av løselig GFP-DISC1 (598-854) i aggregater. (B) Rekombinant α-synuclein (rød) invaderer celler uten rekruttering med en frekvens på ca 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6. Immunofluorescerende bilde avinjisert merket, rekombinant DISC1 (598-785) protein. Z-stack bildebehandling bekrefter tilstedeværelsen av rec. DISC1 (598-785) protein i rotte kortikale nevroner farget med et antistoff mot neuronal kjerner (Neun, grønn).

<ol>
	<li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness.">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease.">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+(640-854)+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C.">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li><li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level:+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes.">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li><li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host.">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li><li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change.">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li><li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain.">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li><li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein.">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li><li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates.">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li><li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease.">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li><li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates.">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li><li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCopathies:+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1.">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

I denne studien vil vi beskrive rensing av mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes fra en transfekterte neuroblastom celle linje, forberedelse og merking av et rekombinant Disc1 protein arter og deres anvendelse i celle-invasjon eksperimenter mottakerlandenes celler in vitro og in vivo. Rensing av native mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes ble utviklet fra protokoller å isolere Lewy body-lignende strukturer og større aggregater 13, 14, men modifisert for å unngå bruk av vaskemidler og for å minimere risikoen for falske positive celle-invasjon som kan oppstå på grunn av vaskemiddel-tilrettelagt membran penetrasjon. En mulig fremtidig forbedring kan være i å ytterligere øke renheten av aggresomes etter sonikering til helt separate gjenværende membraner og cytoskjelettet fra aggresomes. Ved å øke samlet renhet, antall totale invasjon hendelser som registreres for store aggresomes may økes 5. Hvorvidt den begrensede definisjonen av vårt forslag 3-faset sukrose er tilstrekkelig for aggresomes av andre protein arter må prøves, i denne forstand protokollen beskrevet her skal betraktes som et utgangspunkt for individuell optimalisering. Den rensede aggresomes viste seg å være ganske robust i våre hender, ekstra vask trinn (uten vaskemiddel) for å eliminere spor av sukrose ikke signifikant reduserer den totale avkastningen. I en tidligere publikasjon beskrev vi at oligomer montering av DISC1 avhenger distinkte multimerization domener i C-terminus 4 (figur 4). Vi valgte denne fragment for rekombinant løselig uttrykk i E. coli og påfølgende og Ni-NTA rensing. Å overvåke multimerization og sammenligne sin celle invasivitet med en beskrevet celle-invasiv protein som α-synuclein, merket vi DISC1 (598-785) med fluorescerende fargestoff DyLight594, og sammenlignet sincelle-invasivitet med at av like merket α-synuclein. Cellen-invasivitet av rekombinante DISC1 fragmentet ble dramatisk økt sammenlignet med native, full lengde Disc1 aggresomes, sannsynligvis på grunn av sin mindre størrelse, og mye høyere renhet. Igjen synes renhet til å spille en avgjørende rolle i celle-invasivitet. I vårt eksempel de invasive aggresomes rekruttert løselig homolog protein av målet cellelinje som ble rekombinant uttrykt i en løselig, dvs. celle-dispergert form. Uttrykk for en fluorescerende protein (f.eks GFP eller RFP) i mottakeren cellelinjen er en fordel siden den tillater colocalization av invasive aggresomes og rekombinante proteiner innenfor mottakercellen grensen via Z-stack bildebehandling. Cell-invasive Disc1 aggresomes og multimeric fragmenter uttrykt og renset fra E. coli kan være et definerende trekk av et protein konformasjonsforandringer sykdommer knyttet til DISC1, DISC1opathies 15. FEILSØKING: Lav aggresome yield etter sukrosegradient rensing: Den sukrosegradient introdusert i denne protokollen fungerer godt med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående av andre proteiner kan være av variable dimensjoner derfor sukrosen konsentrasjoner bør optimaliseres av andre brukere. Utilstrekkelig rensing av rekombinant protein: Eventuelle bakterielle forurensninger i renseprosessen av det rekombinante protein vil også merkes i senere trinn av protokollen. Å unngå forurensninger, kjøre protein på en SDS-PAGE og bekreft at det rekombinante protein er minst 95% rent ved farging med Coomassie-blå. For å sikre høy kvalitet og kapasitet, har protokollen for å være optimalisert for hver enkelt protein. Lav merking efficiency av rekombinante proteiner: Eventuelle forurensninger som inneholder frie SH-grupper vil redusere effektiv merking av proteinet. Derfor er omfattende dialyse og Ni-NTA basert rensing obligatorisk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensnavnet </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medium avhenger verten cellelinje. Den optimale mottaker cellelinje bør bestemmes av brukeren. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medium avhenger mottakeren cellelinje. Den optimale mottaker cellelinje bør bestemmes av brukeren. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andre transfeksjon reagenser kan fungere så godt, men ble ikke testet med protokoll vår. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Forsøkene ble gjort med Ni_NTA agarose fra Qiagen, bør andre leverandører fungerer så bra. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Det er ingen behov for RNase fri DNase i ferd aggresomes rensing. </td></tr><tr><td> Sukrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serumfritt medium virker like bra </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Tillegg for SH-SY5Y og NLF medium </td></tr><tr><td> Ikke-essensielle-aminosyrer (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Tillegg for SH-SY5Y medium </td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Giftig reagens </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Redusert cystein reactive fargestoff til å danne stabile tioeter obligasjoner. Også tilgjengelig i andre farger. </td></tr><tr><td> Forlenge Gull med DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Dette antifade flytende mountant ga bedre resultater i våre hender. </td></tr><tr><td> Proteasehemmer cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Løs opp 1 bord i 500 ul H 2 O for 100X løsning. </td></tr><tr><td> Syntetisk a-synuclein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Refold som beskrevet i teksten. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell over spesifikke reagenser. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Vi har ikke testet andre mekaniske homogenenizers andre enn dette. Andre vaskemiddel uten homogenisering metoden kan fungere også, men har ikke blitt testet for denne protokollen. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Bare nødvendig hvis protein har til å være konsentrert. </td></tr><tr><td> LSM 510 og Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Se produsenter katalog </td><td> Begge mikroskoper harbor evnen til å utføre Z-stack bildebehandling. Dette er en forutsetning for solid og seriøs evaluering av invasjonsbegivenheter. </td></tr><tr><td> Cellekultur plastmateriale </td><td> Nunc </td><td> 10 cm retter # 172958, 24-brønners plater # 142475 </td><td> Bruken av forskjellig plastmateriale kan påvirke interaksjonen av rekombinante proteiner eller aggresomes og overflater av plast. Vi har ikke testet andre materialer enn de som er beskrevet her. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell over spesifikk materiell og utstyr. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nummer </td><td> Buffer navn </td><td> innhold </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bakterievekst medium </td><td> 16 g / l Bacto Trypton, 10 g / l Bacto gjærekstrakt, 5 g / l NaCl, 5 mM-arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol </td><td> Vokse bakterier til OD 600: 0.6 til 0.8 indusere uttrykk med 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakteriell resuspensjon buffer </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 pg / ml lysozym, 20 mM 2 MgCl og 400 U/50 ml DNase I </td><td> Resupend bakteriell pellet fra 1 L overnight kultur i 50 ml resuspendering buffer. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein utvinning buffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea og 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA kolonne vaskebuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea og 10 mM b-ME, 12 mM imidazol </td><td> Modifisert ekstraksjon buffer med 12 mM imidazol tilsatt. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA kolonne elueringsbuffer </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA og 10 mM b-ME </td><td> Elueringen bufferen inneholder 10 mM b-ME, som er dialysert senere. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / liter NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, juster til pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Merking buffer </td><td> PBS inneholdende 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabell over oppskrifter. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Proteinaggregering ses som en generell kjennetegn av kroniske, degenerative hjernen forhold som for eksempel i de neurodegenerative sykdommer Alzheimers sykdom (Aβ, tau), Parkinsons sykdom (α-synuclein), Huntingtons sykdom (polyglutamine, huntingtin), og andre. Proteinaggregering antas å oppstå på grunn av forstyrret proteostasis, dvs. ubalanse mellom oppstår og nedbrytning av misfolded proteiner. Av notatet, er de samme proteinene funnet aggregert i sporadiske former av disse sykdommene som er mutant i sjeldne varianter av familiære former. Schizofreni er en kronisk progressiv hjernen tilstand som i mange tilfeller går sammen med en permanent og irreversibel kognitiv underskudd. I en kandidat genet tilnærming, undersøkte vi hvorvidt Forstyrret-in-schizofreni 1 (DISC1), et gen klonet i en skotsk familie med ledd til kronisk mental sykdom 1, 2, kan bli funnet som uoppløselige aggregater i Brain av sporadiske tilfeller av schizofreni 3. Bruke SMRI CC, identifiserte vi i ca 20% av tilfellene med CMD, men ikke normale kontrollpersoner eller pasienter med nevrodegenerative sykdommer sarkosyl-uløselig DISC1 immunoreaktivitet etter biokjemisk fraksjonering. Senere studier in vitro viste at aggregering tilbøyelighet DISC1 ble påvirket av sykdomsassosierte polymorfisme S704C 4, og at Disc1 aggresomes generert in vitro var celle-invasiv 5, i likhet med hva hadde blitt vist for Aβ 6, 7-9 tau, α 10-synuclein, 11 polyglutamine eller SOD1 aggregater 12. Disse funnene bedt oss om å foreslå at minst en undergruppe av tilfellene med CMD, kan de med aggregert DISC1 være protein konformasjonsforandringer lidelser. Her beskriver vi hvordan vi genererer Disc1 aggresomes i pattedyrceller, rense dem på en sukrosegradient og bruke dem for celle-invasivitet studies. Tilsvarende beskriver vi hvordan vi genererer en utelukkende multimeric C-terminal DISC1 fragment, etikett og rense det for celle invasivitet studier. Bruke rekombinante multimerer av DISC1 oppnår vi lignende celle invasivitet som for en tilsvarende merket syntetisk α-synuclein fragment. Vi viser også at dette fragment blir tatt opp i vivo når stereotactically injisert i hjernen mottakerland dyr.

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Produksjon, rensing og celle invasjon av intracellulære, cytoplasmatiske full lengde Disc1 protein aggresomes fra cellekulturer og en merket, multimeric rekombinant DISC1 protein fragment i<em&gt; E. coli</em&gt; Er beskrevet. Cell invasivitet vises for mottakerland celler i cellekultur og for neuroner<em&gt; In vivo</em&gt; Etter stereotactical hjernen inokulering.

Generasjon, rensing og karakterisering av Cell-invasive Disc1 Protein Arter

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatisert Hydrofobisk Samspill Kromatografi Kolonne markering for bruk i proteinrensing

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identifisering og karakterisering av protein glykosylering med bestemte endo-og exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Rensing-fri metode for Binding Affinity Fastsettelse av mikroskala Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Oppdager, visualisere og kvantifisere generasjon av reaktive oksygen arter i en Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifisere Protein-protein samhandling i<em&gt; Drosophila</em&gt; Voksen Heads av Tandem Affinitetsrensing (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...