Name: generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av neuron-Eranet upptäcka (BMBF 01EW1003) till CK och JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) till CKVB stöds av ett bidrag på Forschungskommission för Medicinska fakulteten vid universitetet i Düsseldorf.

1. Framställning av Aggresome givarceller: Transfektion av Monomer Röd fluorescerande protein (mRFP) eller Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)-märkta humant Full Length (FL) DISC1 <ol><li> Frö 1,5 x 10 6/10 cm skål mänskligt neuroblastom NLF (NLF, barnsjukhuset i Philadelphia, Philadelphia, PA) celler i tio 10 cm skålar och växa över natten. NLF celler odlas i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% FBS, penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Nästa dag, bör cellerna vara vid 70-80% konfluens. </li><li> Övergående transfektion varje 10 cm skålen med 15 ug plasmid-DNA och Metafectene transfektion reagens (Biontex, Martinsried, Tyskland). I korthet, för en 10 cm skål, var 15 pg plasmid-DNA och 30 pl Metafectene till 750 pl Opti-MEM, blandades och inkuberades vid RT under 20 minuter. 5 rätter transfekterades med pcDNA3.1 mRFP / EGFP-märkta humana (FL) DISC1 och 5 rätter med EGFP-plasmiden ensam. </li></ol> 2. AggresomeRening från transfekterade donatorceller Protokollet som beskrivs här är en kombination av en metod för att rena Lewy-kroppar från hjärnvävnad 13 och ett protokoll för att isolera stora aggregat och aggresomes 14. Eftersom redan existerande metoder är baserade på användningen av detergenter, isoleringen av detergent-fritt protein för tillämpning i cell-invasivt analyser är kritisk. <ol><li> 48 timmar efter transfektion, övervaka uttrycket av EGFP och mRFP/eGFP-DISC1 och bekräfta bildningen av aggresomes under ett fluorescensmikroskop (figur 1). </li><li> Tvätta cellerna med PBS pH 7,4, skrapa med 400 | il PBS vardera, lägg 1X cocktail Protease Inhibitor (Roche, Indianapolis, IN) och sönderdela cellerna med användning av en homogenisator Precellys24 (Bertin Technologies, Frankrike). Kortfattat, tillsätt 1 ml cellsuspension till en 2 ml lys rör och tillsätt 10 keramiska kulor. Lysera cellerna med 3 x 60 sek pulser. Den mekaniska kraft processen kanöka temperaturen i provet över 37 ° C så försiktighet bör vidtas för att kyla provet på is efter lys förfarandet. </li><li> Kyl cellerna på is och tillsätt 10 mM MgClj 2, 40 U / ml DNas A och inkubera under 60 min vid 37 ° C </li><li> Bered lösningar av 80%, 50%, 20% sackaros (vikt / volym) i PBS pH 7,4 (10 ml vardera). </li><li> Förbered sackarosgradient i en 15 ml Falcon-rör, med början med 2 ml 80% sackaros, följt av 50% och 20%. Häll gradienten långsamt och vara noga med att inte störa redan hälls lager. Skiktet digererade lysatet på toppen av gradienten och centrifugera i 15 min vid 1000 xg vid 4 ° C. </li><li> Försiktigt samla interfasen mellan 50-80% sackaros skikt med en pipett och blanda med 5 volymer av PBS pH 7,4. Centrifugera i 15 minuter vid 1000 xg vid 4 ° C. Upprepa tvätta ytterligare två gånger. I detta interfas, aggresomes är fluorescerande och kan visualiseras i ett mikroskop under UV-ljus. </li><li> Kasta bort supernatanten ochåtersuspendera pelleten i 250-500 ^ il PBS pH 7,4. Denna pellet innehåller renade aggresomes (figur 2). </li></ol> 3. Behandling av mottagare SH-SY5Y celler med mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Frö 5 x 10 4 mottagande SH-SY5Y humana neuroblastomceller konstitutivt uttrycker GFP-DISC1 (598-854) på sterila täckglas i varje brunn i en platta med 24 brunnar. SH-SY5Y-cell odlas i DMEM/F-12 medium kompletterat med penicillin / streptomycin, icke-essentiella aminosyror (NEAA) och 10% FBS. </li><li> 24 h senare, tillsätt 10 | il till varje brunn och inkubera under 48-72 timmar. </li><li> Tvätta cellerna 3 x med PBS, pH 7,4 och släcka extracellulär fluorescens med 0,04% Trypan Blue under 5 min. </li><li> Fixera cellerna med 4% PFA i PBS pH 7,4 under 10 min på is, tvätta en gång med sterilt H 2 O och montera täckglasen på glasskivor med förlänga guld med DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA). </li><li> Bekräfta upptaget /invasion av exogent tillämpade aggresomes genom samlokalisering med rekryterade proteiner som uttrycks av mottagande celler i Z-stack bilder. </li></ol> Ändå kan upptag / invasion av exogent protein inte väsentligen detekteras parallellt med rekrytering av värdcellens proteiner. I vårt exempel mRFP-märkt DISC1 aggresomes rekrytera löslig GFP-märkta DISC1 (598-854) protein som uttrycks av värdcellen (se figur 3). Bilder togs på en Zeiss LSM 510 konfokala-eller en Zeiss AxioVision Apotome2 mikroskop. 4. Generering av rekombinant DISC1 (598-785) I en tidigare publikation vi analyserat förmågan hos olika DISC1 proteinfragment att själv interagera bygger på förekomsten av själv-föreningen domäner. Bland alla proteinfragment testade humana DISC1 (598-785) visade den starkaste multimerisering benägenheten 4 (Figur 4). Därför var mänsklig DISC1 (598-785) klonad in pET15b (NejVagen, Madison, Wisconsin) innehållande en N-terminal 6-histidin-tag, uttryckt i E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA) och renades under denaturerande betingelser i 8 mol / l urea som beskrivs 4. I korthet, är det protokoll som beskrivs nedan. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. E. coli odlades i 2 x 500 ml 2YT innehållande 5 mM-arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbencillin, 35 pg / ml kloramfenikol upp till ett OD 600: 0,6-0,8 och DISC1 (598-785) expression inducerades med 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) uttrycktes under 4 h vid 37 ° C, uttrycket avslutades genom skörd av bakterierna genom centrifugering. </li><li> Den bakteriella pelleten återsuspenderades i 50 ml TE-buffert (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 | ig / ml lysozym, 20 mM MgClj och 2 400 U/50 ml DNas I. För att säkerställa fullständig lys, reaktionen inkuberades under 30 min vid RT under försiktig omrörning. </li><li> Lägg 10 mM β-mercaptoethanol (ME) och 500 mM NaCl och inkubera under ytterligare 30 minuter. </li><li> Centrifugera ner bakteriella inklusionskroppar vid 20,000 g under 30 minuter vid 4 ° C. </li><li> Återsuspendera pelleten i 50 ml extraktionsbuffert innehållande 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea och 10 mM β-ME och avlägsna skräp genom centrifugering vid 20,000 g under 30 minuter vid 4 ° C. </li><li> Tvätta Ni-NTA-agarosmatrisen med extraktionsbuffert. Inkubera återsuspenderade, förklarnades proteinextrakt med Ni-NTA-matrisen för 2 h vid RT. </li><li> Tvätta Ni-NTA-matris med extraktionsbuffert innehållande 12 mM imidazol. </li><li> Eluera proteinet långsamt med 15 ml elueringsbuffert innehållande 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M karbamid, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA och 10 mM β-ME. </li><li> Dialysera proteinet stegvis till PBS pH 7,4 innehållande 10 mM β-ME. </li></ol> Från 1 L bakteriell startkultur är det möjligt att isolera upp till 50 mg rekombinant DISC1 (598-785) protein. α-synuklein återveckning För experiment med α-synuklein, 500 pg av det rekombinanta proteinet (Sigma-Aldrich, USA) löstes i PBS vid en koncentration av 1 mg / ml. För att erhålla oligomerer har återveckning genomfördes över natten vid 37 ° C såsom beskrivits i en tidigare publikation 10. 5. Märkning av rekombinant DISC1 (598-785) med DyLight594 <ol><li> Innan den efterföljande märkning processen DISC1 (598-785) proteinet har befrias från β-ME. Därför proteinet dialyseras 3 ggr med PBS pH 7,4 vid en utspädning av 1:2000. </li><li> Etikett 1 mg DISC1 (598-785) med DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet, lös 1 mg / ml protein i PBS, pH 7,4 och tillsätt 5 mM TCEP att återvinna fria tiolgrupper. Tillsätt 20 | il av den upplösta DMF färgämnet till reaktionen och inkubera i 2 h vid RT. </li><li> Dialysera proteinet 3 x med PBS pH7,4 vid ett förhållande av 1:2000 under 2 timmar vardera. </li></ol> För att ytterligare öka renheten hos det märkta proteinet en His 6-märkt baserade affinitets-rening på en Ni-NTA-kolonn utförs. <ol start="4"><li> Tvätta 1 ml Ni-NTA-matris (Qiagen, Tyskland) med 10 ml PBS, pH 7,4. </li><li> Applicera märkta, dialyserade proteinet till kolonnen och låt den gå över kolonnen långsamt. </li><li> Tvätta proteinet med 3 x 20 ml PBS, pH 7,4 </li><li> Eluera proteinet med PBS pH 7,4, 500 mM imidazol droppvis under övervakning av färgade bandet på Ni-NTA-kolonn för att minska volymen eluatet. </li><li> Dialysera eluatet 3 x till 10 mM NaPi, pH 7,4 vid en utspädning av 1:2000 under 2 timmar vardera. </li><li> Använd en steril 0,45 | im sprutfilter för att filtrera eluatet, alikvoten i 5 x 100 ul prov och snap frysa i flytande kväve. Den totala mängden protein bör vara 0,5 till 1 pg / ml i varje 100 pl alikvot. </li></ol> tillval concentrtion steg <ol start="10"><li> För stereotactical råtta injektioner var proteinet koncentrerades 10-faldigt i en Speed-vac (Eppendorf Concentrator 5301). Den slutliga bufferten villkoret var 100 mM NaPi. </li></ol> α-synuklein Labeling Den märkning och rening (Ni-NTA-kolonn) av den rekombinanta α-synuklein utfördes parallellt med DISC1 (598-785). Den totala utgångsmaterialet var 500 pg istället för 1 mg för DISC1 (598-785). 6. Behandling av mottagare SH-SY5Y celler med märkt rekombinant DISC1 (598-785) Protein <ol><li> Seed 5x10 4 mottagande SH-SY5Y humana neuroblastomceller som uttrycker konstitutivt GFP-DISC1 (598-854) på sterila täckglas i varje brunn i en platta med 24 brunnar. </li><li> Lägg märkta proteinet till cellodlingsmediet vid en koncentration av 5-10 pg / ml och inkubera under 48-72 timmar. </li><li> Tvätta cellerna 3 x med PBS, pH 7,4 och släcka utvinningellular fluorescens med 0,04% Trypan Blue under 5 min. </li><li> Fixera cellerna med 4% PFA i PBS pH 7,4 under 10 min på is, tvätta en gång med sterilt H 2 O och montera täckglasen på glasskivor med förlänga guld med DAPI monteringsmedium (Invitrogen, USA). </li><li> Bekräfta upptaget / invasionen av exogent tillämpas rekombinant protein genom samlokalisering med rekryterade proteiner som uttrycks av mottagande celler i Z-stack bilder som genereras av laser scanning konfokalmikroskopi. Ändå, kan rekryteringen av endogent protein inte väsentligt detekteras parallellt med invasion av värdcellprotein, kan Z-stack bilder bekräftar fortfarande den invasiva naturen hos proteinet. </li></ol> I vårt exempel rec. DISC1 (598-785) * åtminstone delvis rekryterar lösliga GFP-märkta DISC1 (598-854) protein som uttrycks av värdcellen (se figur 5A). För rekombinant α-synuklein invasionen men ingen rekrytering visas (Figur 5B). Bilder togspå en Zeiss LSM 510 konfokala-eller en Zeiss AxioVision Apotome2 mikroskop. Injektionen av den koncentrerade (ca 4 pl 2,5 pg / pl), märkt DISC1 (598-785) * i de mPFC resulterar i spridning av proteinet runt injektionsstället som kan detekteras även efter perfusion av djuret med 4% PFA i PBS pH 7,4 med en rodamin filterset. I vårt exempel DISC1 (598-785) tas upp av en distinkt antal nervceller och kan övervakas med Z-stack imaging (Figur 6). I allmänhet injektion av proteiner andra då de används här inte nödvändigtvis leda till cell-invasion. Invasionen händelsen är i huvudsak beroende på arten av det protein, är ändå en ren rening en förutsättning för vidare analys. 7. Representativa resultat Aggresomes bestående av rekombinant FL DISC1-EGFP renat från NLF celler invaderade mottagare SH-SY5Y ceLLS vid låg verkningsgrad (ca 0,3% 5) ses som genom samlokalisering med konfokalmikroskopi (Figur 3). Som tidigare rapporterats, DISC1 (598-785) uttryckt och renat från E. E. coli bildade multimerer 4 var lika cell-invasiv vid en effektivitet av cirka 20% 5 (figur 5A) som liknar den hos α-synuklein som användes parallellt som positiv kontroll (figur 5B). Märkt rekombinant DISC1 (598-785) uttryckt och renat från E. coli var också cell-invasiv till neuroner in vivo när det multimera proteinet stereotaktiskt injiceras i mediala prefrontala cortex hos en råtta (Figur 6, Pum, Bader, Huston, Korth, opublicerad). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. NLF neuroblastomceller som uttrycker transient FP-DISC1 (röd). Röda fluorescerande aggresomes kan försämcted inuti cellerna. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Renad mRFP-märkt DISC1 aggresomes efter rening i en sackarosgradient. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Fluorescerande bild av invaderade aggresomes. mRFP-märkta flDISC1 aggresomes renades och inkuberades med SH-SY5Y neuroblastomceller överuttrycker löslig GFP-märkta DISC1 (598-854). En upptaget av märkta aggresomes övervakas av Z-stapel avbildning på en laser-Scan mikroskop (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. SEC-profil rec. DISC1 (598-785) innehåller S704 och C704 (single nucleotide polymorphisms SNP). Båda varianterna visar en störning av beställda oligomerisering och bildningen av högmolekylära multimers (röd pil). Denna bild är modifierad från offentliggörandet av Leliveld et al. Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. Lysrör Z-stack bild av invasiv DyLight märkt rekombinant DISC1 (598-785). SH-SY5Y neuroblastomceller som uttrycker lösligt GFP-DISC1 (598-854) inkuberades med märkt, rekombinant protein vid en koncentration av 5 pg / ml. (A) Röda aggregat visar invasionen av rek. DISC1 (598-785) protein och gula prickar visar en rekrytering av lösligt GFP-DISC1 (598-854) i aggregat. (B) Rekombinant α-synuklein (röd) invaderar cellerna utan rekrytering med en frekvens på ca 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6. Immunofluorescent bild avden injicerade märkta rekombinant DISC1 (598-785) protein. Z-stack avbildning bekräftar närvaron av rek. DISC1 (598-785)-proteinet i råtta kortikala neuroner färgade med en antikropp mot neuronal kärnor (NeuN, grön).

<ol>
	<li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness.">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease.">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+(640-854)+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C.">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li><li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level:+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes.">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li><li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host.">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li><li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change.">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li><li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain.">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li><li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein.">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li><li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates.">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li><li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease.">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li><li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates.">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li><li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCopathies:+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1.">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

I denna studie beskriver vi rening av mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes från en transfekterad neuroblastomcellinje, förberedelse och märkning av ett rekombinant DISC1 protein arter och deras tillämpning i cell-invasionen experiment mottagande celler in vitro och in vivo. Reningen av nativa mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes utvecklades från protokoll för att isolera Lewy body-liknande strukturer och större aggregat 13, 14, men modifierad för att undvika användning av detergenter och för att minimera risken för falska positiva cell-invasion som kan uppstå på grund av tvättmedel-underlättad membran penetration. En möjlig framtida förbättringar kan vara i att ytterligare öka renheten hos de aggresomes genom sonikering att helt separata kvarvarande membran och cytoskeleton från aggresomes. Genom att öka totala renhet, det totala antalet invasion händelser som registrerats för stora aggresomes may ökas 5. Huruvida den begränsade definitionen av vårt förslag 3-fas sackaros är tillräcklig för aggresomes av andra proteiner arter måste testas, i denna mening det protokoll som beskrivs här ska ses som en utgångspunkt för individuell optimering. De renade aggresomes visade sig vara ganska robusta i våra händer, ytterligare steg tvätt (utan rengöringsmedel) för att eliminera spår av sackaros inte signifikant minska den totala avkastningen. I en tidigare publikation beskrev vi att oligomer montering av DISC1 är beroende distinkta multimerisering domäner i C-terminalen 4 (Figur 4). Vi valde detta fragment för rekombinant löslig uttryckning i E. coli och efterföljande och Ni-NTA-rening. Att övervaka multimerisering och jämföra sin cell invasivitet med beskrivna cell-invasiv protein som α-synuklein, märkt vi DISC1 (598-785) med fluorescerande färgämne DyLight594, och jämfört sincell-invasivitet med den av lika märkt α-synuklein. Cell-invasivitet av den rekombinanta DISC1 fragmentet dramatiskt jämfört med den hos nativ, fullängds DISC1 aggresomes, sannolikt på grund av dess mindre storlek och mycket högre renhet. Återigen verkar renhet att spela en avgörande roll i cell-invasivitet. I vårt exempel de invasiva aggresomes rekryterade lösligt homolog protein av mål-cellinjen som rekombinant uttrycktes i en löslig, dvs cell-dispergerad form. Uttryckningen av ett fluorescerande protein (t.ex. GFP eller RFP) i den mottagande cellinjen är en fördel eftersom den möjliggör samlokalisering av invasiva aggresomes och rekombinanta proteiner inom den mottagande cellen gränsen via Z-stack avbildning. Cell-invasiva DISC1 aggresomes och multimera fragment uttrycks och renas från E. E. coli kan vara ett utmärkande drag av ett protein konformationssjukdomar sjukdomar relaterade till DISC1, DISC1opathies 15. Felsökning: Låg aggresome utbyte efter sackarosgradient rening: Den sackarosgradient införas i detta protokoll fungerar bra med eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes bestående av andra proteiner kan vara av varierande dimensioner därför sackaros koncentrationerna bör optimeras av andra användare. Otillräcklig rening av rekombinant protein: Eventuella bakteriella föroreningar i reningsprocessen av det rekombinanta proteinet kommer också att märkas i senare steg i protokollet. För att undvika kontaminering, köra proteinet på en SDS-PAGE och bekräfta att det rekombinanta proteinet är åtminstone 95% ren genom färgning med Coomassie-blått. För att säkerställa högsta kvalitet och avkastning har protokollet optimeras för varje enskild protein. Låg märkning efningsgrad av rekombinanta proteiner: Eventuella föroreningar som innehåller fria SH-grupper kommer att minska effektiv märkning av proteinet. Därför är omfattande dialys och Ni-NTA baserad rening obligatorisk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Mediet är beroende av värdcellinjen. Den optimala mottagande cellinjen bör bestämmas av användaren. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Mediet är beroende av mottagande cellinjen. Den optimala mottagande cellinjen bör bestämmas av användaren. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andra transfektionsreagens kan fungera också, men testades inte med vår protokoll. </td></tr><tr><td> Ni-NTA-agaros </td><td> Qiagen </td><td> 30.210 &lt;/ Td&gt; <td> Experimenten gjordes med Ni_NTA agaros från Qiagen bör andra leverantörer fungerar så bra. </td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Det finns inget behov för RNas fritt DNas i processen för aggresomes rening. </td></tr><tr><td> Sackaros </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serumfritt medium fungerar lika bra </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Tillägg för SH-SY5Y och NLF-medium </td></tr><tr><td> Icke-essentiella-aminosyror (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Tillägg för SH-SY5Y-medium </td></tr><tr><td> Trypanblått 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Giftig reagens </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46.608 </td><td> Minskad färg cystein reaktiv att bilda stabila tioeterbindningar. Finns även i andra färger. </td></tr><tr><td> Förläng Guld med DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Denna antifad vätska monteringsmedel gav bättre resultat i våra händer. </td></tr><tr><td> Proteasinhibitorcocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Lös 1 i tabellen i 500 ^ H 2 O för 100X lösning. </td></tr><tr><td> Syntetisk a-synuklein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Återveckning såsom beskrivits i texten. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell över specifika reagenser. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Vi har inte testat andra mekaniska homogennizers än detta. Andra tvättmedel utan homogenisering metod kan fungera lika bra, men de har inte testats för detta protokoll. </td></tr><tr><td> 5301 koncentrator (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Endast nödvändigt om protein måste koncentreras. </td></tr><tr><td> LSM 510 och AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Se tillverkare katalog </td><td> Båda mikroskop härbärgerar förmågan att utföra Z-stack avbildning. Detta är en förutsättning för stabil och seriös utvärdering av invasion händelser. </td></tr><tr><td> Cellodling plastmaterial </td><td> Nunc </td><td> 10 cm skålar # 172.958, 24-brunnars plattor # 142.475 </td><td> Användningen av olika plastmaterial kan påverka interaktionen av rekombinanta proteiner eller aggresomes och plastytor. Vi har inte testat andra material än de som beskrivs här. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell över specifika material och utrustning. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nummer </td><td> Buffert namn </td><td> innehåll </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bakteriellt tillväxtmedium </td><td> 16 g / liter Bacto trypton, 10 g / liter Bacto jästextrakt, 5 g / l NaCI, 5 mM arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbencillin, 35 pg / ml kloramfenikol </td><td> Odla bakterier till OD 600: 0,6-0,8 inducera expression med 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakteriell resuspension buffert </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 | ig / ml lysozym, 20 mM MgClj och 2 400 U/50 ml DNas I </td><td> Resupend bakteriepelleten från 1 L overnight kultur i 50 ml resuspension buffert. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein extraktionsbuffert </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea och 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA-kolonn tvättbuffert </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M urea och 10 mM b-ME, 12 mM imidazol </td><td> Modifierad extraktionsbuffert med 12 mM imidazol tillsattes. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA-kolonn elueringsbuffert </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M karbamid, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA och 10 mM b-ME </td><td> Elueringsbufferten innehåller 10 mM b-ME, som dialyseras senare. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / liter NaCl, 0,2 g / liter KCl, 1,44 g / liter Na 2 HPO 4, 0,24 g / liter KH 2 PO 4, justera till pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Märkning buffert </td><td> PBS innehållande 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabell över recept. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Proteinaggregation ses som en allmän kännetecken av kroniska, degenerativa hjärnan tillstånd som, till exempel, i de neurodegenerativa sjukdomar Alzheimers sjukdom (Ap, tau), Parkinsons sjukdom (α-synuklein), Huntingtons sjukdom (polyglutamine, huntingtin), och andra. Proteinaggregering tros uppstå på grund av störd proteostasis, dvs obalansen mellan uppkomsten och nedbrytning av felveckade proteiner. Av notera är samma proteiner hittades aggregeras i sporadiska former av dessa sjukdomar som är mutant i sällsynta varianter av familjär former. Schizofreni är en kronisk progressiv hjärna tillstånd som i många fall går längs med en permanent och oåterkallelig kognitiva underskott. I en kandidat gen metod undersökte vi om Störd-i-schizofreni 1 (DISC1), en gen klonad i en skotsk familj med koppling till kronisk psykisk sjukdom 1, 2, kunde hittas som olösliga aggregat i brain sporadiska fall av schizofreni 3. Med hjälp av SMRI CC identifierade vi i ungefär 20% av fallen med CMD men inte normala kontroller eller patienter med neurodegenerativa sjukdomar sarkosyl olöslig DISC1 immunreaktivitet efter biokemisk fraktionering. Senare studier in vitro visade att sammanläggning benägenhet DISC1 påverkades av sjukdomsassocierad polymorfism S704C 4 och att DISC1 aggresomes genereras in vitro var cell-invasiv 5, liknande vad som visats för Ap 6, 7-9 tau, α -synuklein 10, 11 polyglutamine, eller SOD1 aggregat 12. Dessa fynd fick oss att föreslå att åtminstone en delmängd av fall med CMD kan de med aggregerad DISC1 vara protein konformationella störningar. Här beskriver vi hur vi skapar DISC1 aggresomes i däggdjursceller, rena dem på en sackarosgradient och använda dem för cell-invasivt studies. Likaså beskriver vi hur vi skapar ett exklusivt multimera C-terminala DISC1 fragment, etikett och rena det för studier cell invasivitet. Använda rekombinanta multimerer av DISC1 vi uppnå samma cell invasivitet som för en liknande märkt syntetisk α-synuklein fragmentet. Vi visar också att detta fragment tas upp in vivo när stereotaktiskt injiceras i hjärnan hos mottagande djur.

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Produktion, rening och cell invasion av intracellulära, cytoplasmiska fulla protein längd DISC1 aggresomes från cellkulturer och en märkt, multimert rekombinant DISC1 proteinfragment i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Beskrivs. Cell invasivitet visas för mottagande celler i cellodling och för neuroner<em&gt; In vivo</em&gt; Efter stereotactical hjärna ympning.

Generation, rening och karakterisering av Cell-invasiva arter DISC1 Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Rening av M. magneticum Sila AMB-1 Magnetosome Medverkande Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

En icke-invasiv Hair provtagningsteknik för att med hög kvalitet DNA från Elusive små däggdjur

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatiserad Hydrofob Interaktion kromatografikolonn val för användning i Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Rening av Hsp104, ett protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identifiering och karakterisering av protein glykosylering med särskilda endo-och exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Att upptäcka, Visualisering och kvantifiering Generation av reaktiva syreradikaler i en Amoeba modellsystem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifiera protein-proteininteraktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Vuxen Heads av Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...