Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Forfatterne takker delstaten Baden-Württemberg og Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - til finansiering ZAFH-PHOTON n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) for finansiering af forskning tilskud no. 1792C08 samt Baden-Württemberg-Stiftung GmbH til finansiering af projektet &quot;Aurami&quot;.

1. Podning og inkubation af celler <ol><li> Seed individuelle celler, fx U373-MG eller U-251-MG glioblastoma-celler med en typisk densitet på 100 celler / mm 2 på et objektglas og dyrke dem i 4872 timer i dyrkningsmedium (fx RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt kalveserum og antibiotika) ved anvendelse af en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. </li><li> Cellerne inkuberes med en membran markør, fx 6-dodecanoyl-2-dimethylamino-naphthalen (laurdan) påført i 60 minutter v...

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

Der beskrives en fremgangsmåde til måling af celle-substrat-afstande med nanometer præcision. I øjeblikket metoder til super-opløsning mikroskopi, fx baseret på struktureret belysning 7 eller på enkelt molekyle detektion 8-10 samt stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi 11 er af betydelig interesse. Ingen af ​​disse teknikker er imidlertid, tillader en aksial opløsning under 50 nm. Desuden W / cm 2 ret høj bestråling på 50.100 er nødvendig for ...

Når en lysstråle udbreder sig gennem et medium med brydningsindex n 1 møder en grænseflade til et andet medium af brydningsindeks n2 &lt;n1, total intern refleksion forekommer i alle indfaldsvinkler Θ, som er større end den kritiske vinkel Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Trods bliver totalt reflekteret den indfaldende lysstråle fremkalder en rumligt dæmpede elektromagnetiske felt, der trænger ind i det andet medium og henfalder eksponentielt med vinkelrette afstand z fra grænsefladen ifølge I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) svarer til intensiteten af ​​det elektromagnetiske felt og d (Θ) til indtrængningsdybden ved bølgelængden λ, som givet ved d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Som rapporteret i litteraturen 1,2, I 0 </sub&gt; svarer til intensiteten af indfaldende lys I e ganget med transmissionen faktor T (Θ) og forholdet n 2 / n 1. Hvis det elektriske felt vektor af denne lysstråle er polariseret vinkelret på planet af forekomsten (dvs. planet udspændt af den indfaldende og den reflekterede stråle), er denne transmissionsfaktor givet ved T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (N 2 / nL 1) 2] For den detekterede fluorescens-intensitet i TIRFM målinger, har lysabsorption, der skal integreres over alle lag i prøven og multipliceret med fluorescens kvantumudbytte η af den pågældende farvestof og med topvinklen i detektion Ω. Som rapporteret tidligere 3, kan denne intensitet blive beskrevet ved I F (Θ) = AT (Θ) nOC (Z) e-z / d (Θ) dz hvis alle de faktorer, der er uafhængige f<html> rom indfaldsvinklen Θ og koordinat z er indbefattet inden for eksperimentel konstant A. Ligning 3 kan løses analytisk, hvis koncentrationen c (z) af fluoroforer anses for at være næsten konstant - Enten overhovedet koordinaterne z ≥ Δ, fx i cytoplasmaet af celler med en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde har integralet skal beregnes ud fra z = Δ til z = ∞ resulterer i Jeg F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Eller mellem z = Δ - t / 2 og z = Δ + t / 2, dvs i et tyndt lag af tykkelsen t, fx en cellemembran beliggende i en afstand Δ fra grænsefladen. I dette tilfælde kan fluorescensintensiteten beregnes som Jeg F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), hvis t er lille i sammenligning med Δ. ent &quot;&gt; Fra ligningerne (4) og (5) celle-substrat-afstande Δ kan beregnes, hvis billeder af fluorescensintensitet I F registreres for variable vinkler Θ, og hvis ln (I F / T d) (ligning 4) eller ln (I F / T) (ligning 5) vurderes som funktion af 1 / d for disse vinkler. For membranen markør laurdan anvendes i dette dokument (s, nedenfor) evalueringen blev udført ifølge ligning. fem. Som rapporteret tidligere 3, image erhvervelse og evaluering kræver - Homogen fordeling af excitationslyset over prøven, - Gyldigheden af en 2-lags model (med brydningsindekserne n 1 og N2 i substratet og cytoplasmaet, henholdsvis). Dette gælder, når plasmamembranen er meget tynd, og hvis laget af det ekstracellulære medium (mellem cellen og substratet) er lille i forhold til bølgelængden for det indfaldende lys. Endvidere kan en moderat numerisk apertur(Typisk A ≤ 0,90) af mikroskopet objektivlinsen er fordelagtigt at undgå afvigelser i lysstyrken på grund af anisotropi af stråling i den nærmeste område af det dielektriske grænseflade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Type </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminar strømning </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1,2 DA GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% penicillin / streptomycin </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Dyrkningsmedium </td></tr><tr><td> Glasobjekt dias </td><td> Marienfeld </td><td> Ren hvid glas </td><td> Specialrengøring anvendte fremgangsmåde </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino-naphthalen (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Fluorescerende markør (Stamopløsning: 2 mM i ethanol) </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiode </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 med driver PDL 800-B </td><td> Bølgelængde: 391 nm </td></tr><tr><td> Single-mode fiber system </td><td> Punktkilde </td><td> kineFlex </td><td> Brugt med kollimering optik </td></tr><tr><td> EMCCD kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Tilbage belyst kamera </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Overflade topologi, fx af celler, der vokser på et substrat, bestemmes med nanometer præcision ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM). Cellerne dyrkes på gennemsigtige objektglas og inkuberet med en fluorescerende markør homogent fordelt i deres plasmamembran. Belysning sker ved en parallel laserstråle under variable vinkler af total indre refleksion (TIR) ​​med forskellige indtrængningsdybder af det rumligt dæmpede elektromagnetiske felt. Optagelse af fluorescensbilleder ved bestråling ved omkring 10 forskellige vinkler tillader at beregne celle-substrat-afstande med en præcision på nogle få nanometer. Forskelle i adhæsion mellem forskellige cellelinier, fx cancerceller og mindre maligne celler, bestemmes således. Endvidere kan eventuelle ændringer i celleadhæsion ved kemisk eller fotodynamisk behandling undersøges. I sammenligning med andre metoder til super-opløsning mikroskopi lys eksponering holdesmeget lille, og ingen beskadigelse af levende celler forventes at forekomme.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologi af celleadhæsion på et substrat måles med nanometer præcision ved variabel vinkel total intern refleksion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM).

Nanotopology af celleadhæsion ved variabel-Angle total intern refleksion Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Bead Aggregation Analyser til karakterisering af formodede celleadhæsionsmolekyler

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høj opløsning Spatiotemporal Analyse af receptor Dynamics ved Single-molekyle fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoaktiveret Lokalisering Mikroskopi med bimolekylær Fluorescens Komplementering (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescens Mikroskopi på Planar Understøttet dobbeltlag

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...