Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

De auteurs danken de deelstaat Baden-Württemberg en de Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - voor de financiering van ZAFH-foton n, het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) voor de financiering van onderzoek subsidie ​​niet. 1792C08 evenals de deelstaat Baden-Württemberg-Stiftung GmbH voor de financiering van het project &quot;Aurami&quot;.

1. Zaaien en incubatie van cellen <ol><li> Seed individuele cellen, bijvoorbeeld U373-MG of U-251 MG-glioblastoma cellen bij een typische dichtheid van 100 cellen / mm 2 op een glasplaatje en ze 4872 uur in kweekmedium groeien (bijv. RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica) met een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Incuberen met een membraan marker, bijv. 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) toegepast gedurende 60 min in een co...

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

Een methode wordt beschreven voor het meten van cel-substraat afstanden nanometer precisie. Op dit moment, de wijze van super-resolutie microscopie, bijvoorbeeld op basis van gestructureerde verlichting 7 of op single molecule detectie 8 tot 10 en stimulated emission depletion (STED) microscopie 11 zijn van groot belang. Geen van deze technieken maakt echter een axiale resolutie van minder dan 50 nm. Bovendien vrij hoge bestraling van 50100 W / cm 2 nodig voor enkel m...

Wanneer een lichtbundel voortplant door een medium brekingsindex n1 een interface aan een tweede medium brekingsindex n2 &lt;n 1, totale interne reflectie optreedt bij alle invalshoeken Θ, die groter zijn dan de kritische hoek Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Ondanks dat volledig gereflecteerd de invallende lichtbundel roept een verdwijnende elektromagnetisch veld dat in het tweede medium en vervalt exponentieel met loodrechte afstand z van het grensvlak dringt volgens I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) overeenkomt met de intensiteit van het elektromagnetische veld en d (Θ) de penetratiediepte bij golflengte λ, zoals gegeven door d (Θ) = (λ/4π) (1 2 n sin 2 Θ - 2 2 n) -1 / 2 Zoals gemeld in de literatuur 1,2, I 0 </sub&gt; overeenkomt met de intensiteit van invallend licht I e vermenigvuldigd met de transmissiefactor T (Θ) en de verhouding n 2 / n 1. Indien het elektrisch veld vector van deze lichtbundel gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval (de vlak opgespannen door de invallende en de gereflecteerde bundel) bevindt het transmissiecoëfficiënt van de T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Voor de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit in TIRFM metingen lichtabsorptie te worden geïntegreerd over alle lagen van het monster en vermenigvuldigd met de fluorescentie quantum opbrengst η van de desbetreffende kleurstof als de ruimtehoek van detectie Ω. Zoals eerder 3, kan deze intensiteit worden beschreven Ik F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz als alle factoren die onafhankelijk zijn f<html> rom de invalshoek Θ en z de coördinaat vallen binnen de experimentele constant A. Vergelijking 3 kan analytisch opgelost als de concentratie c (z) van fluoroforen wordt beschouwd als bijna constant - Op alle coördinaten z ≥ Δ, bijvoorbeeld in het cytoplasma van cellen met een afstand Δ van de interface. In dit geval integraal moet worden berekend z = Δ z = ∞ tot gevolg Ik F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Tussen z = Δ - t / 2 en z = Δ + T / 2, dat wil zeggen in een dunne laag van dikte t, bijvoorbeeld een celmembraan op een afstand Δ van de interface. In dit geval kan de fluorescentie intensiteit berekend als Ik F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), Als t klein in vergelijking met Δ. ent &quot;&gt; Uit de vergelijkingen (4) en (5) cel-substraat afstanden Δ kan worden berekend als de beelden van fluorescentie intensiteit I F opgenomen voor variabele hoeken Θ en als ln (I F / T d) (Vgl. 4) of ln (I F / T) (Vgl. 5) wordt bepaald als functie van 1 / d voor deze hoeken. Voor de membraan marker laurdan die in dit document (s. hieronder) evaluatie werd uitgevoerd volgens Vgl. 5. Zoals eerder gerapporteerd 3, beeldacquisitie en evaluatie vereist - Een homogene verdeling van excitatie licht op het monster, - Geldigheid van een 2-laags model (de brekingsindices n 1 en n 2 voor het substraat en het cytoplasma, respectievelijk). Dit geldt als de plasmamembraan is zeer dun, en indien de laag van het extracellulaire medium (tussen de cel en het substraat) klein is vergeleken met de golflengte van invallend licht. Bovendien een matige numerieke apertuur(Meestal A ≤ 0,90) van de microscoop objectieflens voordeel zijn wanneer afwijkingen van helderheid door anisotropie van straling in het nabije veld van de diëlektrische interface.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Type </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Broedmachine </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminaire stroming </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1,2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% penicilline / streptomycine </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Kweekmedium </td></tr><tr><td> Glazen voorwerp dia&#39;s </td><td> Marienfeld </td><td> Zuiver wit glas </td><td> Speciale gebruikt reinigingsprocedure </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Fluorescente merker (voorraadoplossing: 2 mM in ethanol) </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiode </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 met chauffeur PDL 800-B </td><td> Golflengte: 391 nm </td></tr><tr><td> Single mode fiber-systeem </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Gebruikt met optieksysteem </td></tr><tr><td> EMCCD camera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Terug verlicht camera </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Oppervlakte topologie, bijv. cellen die groeien op een substraat, wordt bepaald met nanometer precisie door Variable Angle-Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM). Cellen worden gekweekt op objectglaasjes transparante en geïncubeerd met een fluorescente merker homogeen verdeeld in de plasmamembraan. Verlichting vindt plaats door een parallelle laserbundel onder variabele hoek van totale interne reflectie (TIR) ​​met verschillende penetratiediepten van het evanescente elektromagnetische veld. Opnemen van fluorescentiebeelden bij bestraling ongeveer 10 verschillende hoeken toestaat cel-substraat afstanden te berekenen met een nauwkeurigheid van enkele nanometers. Verschillen van hechting tussen verschillende cellijnen, bijv. kankercellen en minder kwaadaardige cellen zijn dus bepaald. Bovendien kunnen mogelijke veranderingen van celadhesie op chemische of fotodynamische behandeling onderzocht. In vergelijking met andere methoden van super-resolutie microscopie belichting wordt gehoudenzeer klein, en geen beschadiging van levende cellen wordt verwacht.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologie van celhechting op een substraat wordt gemeten met nanometer precisie door variabele hoek totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM).

Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...