Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
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Les auteurs remercient le Land de Bade-Wurtemberg et la Europäische Union Europäischer Fonds regionale Entwicklung für die - pour le financement ZAFH-PHOTON n, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) pour la recherche des subventions non. 1792C08 ainsi que la GmbH Baden-Württemberg-Stiftung pour le financement du projet &quot;Aurami&quot;.

1. Ensemencement et incubation des cellules <ol><li> Cellules individuelles de semences, par exemple U373-MG ou des cellules de glioblastome U-251-MG à une densité typique de 100 cellules / mm 2 sur une lame de verre et les cultiver pour 4872 heures en milieu de culture (par exemple RPMI 1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et des antibiotiques) à l&#39;aide d&#39;un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Incuber les cellules avec un marqueur membranaire,...

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. 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L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. 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On décrit une méthode de mesure de la cellule-substrat distances avec une précision nanométrique. À l&#39;heure actuelle, les méthodes de microscopie de super-résolution, fondée par exemple sur l&#39;éclairage structuré 7 ou sur simple 8-10 de détection des molécules ainsi que l&#39;appauvrissement de l&#39;émission stimulée (STED) microscopie à 11 sont d&#39;un intérêt considérable. Aucune de ces techniques, cependant, permet une résolution axiale inférieure...

Lorsqu&#39;un faisceau lumineux se propageant à travers un milieu d&#39;indice de réfraction n 1 répond à une interface avec un second milieu d&#39;indice de réfraction n 2 &lt;n 1, la réflexion totale interne se produit à tous les angles d&#39;incidence Θ, qui sont plus grand que l&#39;angle critique Θ = c arcsin (n 2 / n 1). Tout en étant totalement réfléchie du faisceau lumineux incident évoque un champ électromagnétique évanescent qui pénètre dans le second milieu, et décroît exponentiellement avec la distance perpendiculaire à partir de l&#39;interface z selon I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) correspond à l&#39;intensité du champ électromagnétique et d (Θ) de la profondeur de pénétration de longueur d&#39;onde λ, telle que donnée par d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Comme indiqué dans la littérature 1,2, I 0 </sUB&gt; correspond à l&#39;intensité de la lumière incidente I e multiplié par le facteur de transmission T (Θ) et le rapport n 2 / n 1. Si le vecteur de champ électrique de ce faisceau de lumière est polarisée perpendiculairement au plan d&#39;incidence (c&#39;est à dire le plan défini par l&#39;incident et le faisceau réfléchi), ce facteur de transmission est donnée par T (Θ) = 4 cos Θ 2 / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Pour l&#39;intensité de fluorescence détectée à des mesures TIRFM, absorption de la lumière doit être intégrée sur toutes les couches de l&#39;échantillon et multiplié par le rendement quantique de fluorescence du colorant η pertinent ainsi que de l&#39;angle solide de détection de Ω. Comme indiqué précédemment 3, cette intensité peut être décrite par I F (Θ) = A (Θ) OC (z) e-z / j (Θ) dz si tous les facteurs qui sont indépendants f<html> rom l&#39;angle d&#39;incidence Θ et la coordonnée z sont inclus dans l&#39;équation A. constante expérimentale 3 peut être résolu analytiquement, si la concentration (z) c de fluorophores est considéré comme à peu près constante - Soit à toutes les coordonnées z ≥ Δ, par exemple, dans le cytoplasme des cellules ayant un Δ la distance de l&#39;interface. Dans ce cas, l&#39;intégrale doit être calculée à partir de z = Δ z = ∞ entraînant I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / j (Θ) - Ou entre z = Δ - t / 2 et z = Δ + t / 2, c&#39;est à dire à l&#39;intérieur d&#39;une couche mince d&#39;épaisseur t, par exemple, une membrane de la cellule située à une distance à partir de l&#39;interface de Δ. Dans ce cas, l&#39;intensité de la fluorescence peut être calculé comme I F = A c T (Θ) te-Δ / j (Θ), si t est faible par rapport à Δ. ent &quot;&gt; De équations (4) et (5) la cellule-substrat distances Δ peut être calculée, si les images d&#39;intensité de fluorescence I F sont enregistrés pour des angles variables Θ, et si ln (I F / T d) (Eq. 4) ou ln (I F / T) (Eq. 5) est évaluée en fonction de 1 / d pour ces angles. Par le marqueur membranaire Laurdan utilisé dans le présent document (a. ci-dessous) l&#39;évaluation a été effectuée selon l&#39;équation. 5. Comme indiqué précédemment 3 d&#39;acquisition d&#39;images, et de l&#39;évaluation nécessite - Une répartition homogène de la lumière d&#39;excitation sur l&#39;échantillon, - La validité d&#39;un modèle de couche 2-(avec les indices de réfraction n 1 et n 2 pour le substrat et le cytoplasme, respectivement). Il en est, si la membrane plasmique est très mince, et si la couche du milieu extracellulaire (entre la cellule et le substrat) est faible par rapport à la longueur d&#39;onde de la lumière incidente. En outre, une ouverture modérée numérique(Typiquement 0,90 ≤ A) de l&#39;objectif de microscope est avantageux d&#39;éviter les écarts de luminosité dues à l&#39;anisotropie du rayonnement dans le champ proche de l&#39;interface diélectrique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Type </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> À flux laminaire </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1.2 FR GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de pénicilline / streptomycine </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> Milieu de culture </td></tr><tr><td> Objet qui glisse en verre </td><td> Marienfeld </td><td> Pur verre blanc </td><td> Procédure de nettoyage spécial utilisé </td></tr><tr><td> 6-dodécanoyl-2-diméthylamino naphtalène (Laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marqueur fluorescent (solution stock: 2 mM dans l&#39;éthanol) </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Diode laser </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 avec pilote PDL 800-B </td><td> Longueur d&#39;onde: 391 nm </td></tr><tr><td> Simple mode fibre </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Utilisé avec une optique de collimation </td></tr><tr><td> Caméra EMCCD </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Caméra rétro-éclairé </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Topologie de surface, par exemple des cellules en croissance sur un substrat, est déterminée avec une précision nanométrique à angle variable par microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM). Les cellules sont cultivées sur des lames transparentes, et mis en incubation avec un marqueur fluorescent réparti de façon homogène dans la membrane plasmique. Illumination se produit par un faisceau laser parallèle sous des angles variables de réflexion interne totale (TIR) ​​à différentes profondeurs de pénétration du champ électromagnétique évanescent. L&#39;enregistrement des images de fluorescence lors d&#39;une irradiation à environ 10 sous différents angles permet de calculer les distances cellule-substrat avec une précision de quelques nanomètres. Les différences d&#39;adhérence entre différentes lignées cellulaires, les cellules cancéreuses et les cellules par exemple moins malignes, sont ainsi déterminés. En outre, les changements possibles de l&#39;adhésion cellulaire sur un traitement chimique ou photodynamique peut être examiné. En comparaison avec d&#39;autres méthodes de super-résolution exposition à la lumière microscope est maintenudes dommages très petite, et pas de cellules vivantes devrait avoir lieu.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologie de l&#39;adhésion cellulaire sur un substrat est mesurée avec une précision nanométrique par microscopie à angle variable fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM).

Nanotopology d&#39;adhésion cellulaire sur Microscopie à angle variable de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

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Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...