Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

המחברים מודים הארץ באדן וירטמברג וEuropäische האיחוד יורופאישר Fonds für die Regionale Entwicklung - למימון ZAFH פוטון n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) למימון מחקר מענק לא. 1792C08 כמו גם באדן וירטמברג-Stiftung GmbH למימון הפרויקט &quot;Aurami&quot;.

1. זריעה ודגירה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בודד, למשל U373-MG או תאי glioblastoma U-251-MG בצפיפות אופיינית של 100 תאים / מ&quot;מ 2 בשקופית זכוכית ולגדל אותם לשעת 4872 במדיום התרבות (למשל RPMI 1640 בתוספת 10% עגל בסרום עוברי ואנטיביוטיקה) בא...

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

שיטה מתוארת למדידת מרחקי תא מצע בדייקנות ננומטר. נכון להיום, שיטות של מיקרוסקופיה רזולוצית סופר, המבוססות למשל על תאורה מובנית 7 או במולקולה בודדה 8-10 זיהוי, כמו גם ירידה בכמות פליטה מאולצת (STED) מיקרוסקופיה 11 הן בעלות עניין רב. אף אחת מהשיטות הללו,...

כאשר קרן אור מתפשטת דרך מדיום של המדד N 1 שבירה עונה ממשק למדיום שני של מקדם שבירת n 2 &lt;1 n, ההשתקפות הפנימית מוחלטת מתרחשת בכל הזוויות של השכיחות Θ, שהם גדולים יותר מהזווית הקריטית Θ ג = arcsin (n 2 / n 1). למרות ששקף לחלוטין את אלומת אור התקרית מעוררת שדה האלקטרומגנטי חלוף שחודר לתוך המדיום והדועך אקספוננציאלית עם ניצב מרחק z מהממשק 2 לפי (z) = 0 אני ez / ד (Θ). אני (z) תואם את עוצמת השדה האלקטרומגנטי וד (Θ) לעומק החדירה באורך הגל λ, כפי שנמסר על ידי ד (Θ) = (λ/4π) (1 2 חטא n 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 כפי שדווח בספרות 1,2, אני 0 </sUB&gt; מתאים לעוצמת אור תקרית שהדואר מוכפל בהעברת הגורם T (Θ) והיחס n 2 / n 1. אם וקטור השדה החשמלי של קרן האור מקוטב זה ניצב למישור פגיע (כלומר המטוס מורחב על ידי האירוע והקרן משתקפת), גורם תמסורת זו ניתן על ידי T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / NL 1) 2] לעוצמת הקרינה התגלתה במדידות TIRFM, ספיגת אור צריכה להיות משולבת על כל השכבות של המדגם והתרבה ​​עם פלואורסצנטי קוונטי התשואה η של הצבע הרלוונטי, כמו גם עם הזווית המוצקה של זיהוי Ω. כפי שדווח בעבר 3, בעצמה זו יכולה להיות מתוארת על ידי אני F (Θ) = AT (Θ) OC (z) דואר z / ד (Θ) dz אם כל הגורמים שהם f עצמאי<html> rom זווית פגיעת Θ והקואורדינטה z כלול בתוך משוואת א המתמדת הניסיונית 3 ניתן לפתור אנליטית, אם הריכוז ג (z) של fluorophores נחשב להיות כמעט קבוע - או בכל הקואורדינטות z ≥ Δ, למשל בתוך הציטופלסמה של תאים בעלי מרחק Δ מהממשק. במקרה זה, יש נפרד, שיחושב מz = Δ לz = ∞ וכתוצאה מכך אני F = ג T (Θ) ד (Θ) דואר Δ / ד (Θ) - או בין z = Δ - t / 2 ו-Z = Δ + t / 2, כלומר בתוך שכבה דקה של t עובי, למשל קרום תא ממוקם במרחק Δ מהממשק. במקרה זה, עוצמת הקרינה יכולה להיות מחושבת כ אני F = ג T (Θ) טה-Δ / ד (Θ), אם לא הוא קטן בהשוואה לΔ. &gt; &quot;אף אוזן גרון ממשוואות (4) ו (5) מרחקי תא מצע Δ ניתן לחשב, אם תמונות של עוצמת קרינה אני F נרשמים לזוויות משתנות Θ, ואם ln (אני F / T ד) (Eq. 4) או ln (אני F / T) (Eq. 5) מוערך כפונקציה של 1 / ד לזוויות אלה. לקרום סמן laurdan השתמש בנייר הזה (סעיף להלן) ההערכה בוצעה על פי משוואה. 5. כפי שדווח בעבר 3, תמונת רכישה וההערכה דורשת - הפצה הומוגני של אור עירור על המדגם, - תוקפו של מודל 2-שכבה (עם מדדי שבירת n 1 ו n 2 למצע וציטופלסמה, בהתאמה). זה מחזיק, אם קרום הפלזמה הוא דק מאוד, ואם השכבה של מדיום החוץ התאי (בין התא והמצע) היא קטנה בהשוואה לאורך הגל של אור אירוע. בנוסף, צמצם מספרי מתון(בדרך כלל ≤ 0.90) של עדשת המיקרוסקופ המטרה הוא יתרון, כדי למנוע סטיות של בהירות בשל אנאיזוטרופיה של קרינה בתחום הקרוב של הממשק דיאלקטרי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> סוג </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> זרימה למינרית </td><td> הולטן בטוח </td><td> S2010 1.2 EN ג&quot;ג 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> טיפוח בינוני </td></tr><tr><td> שקופיות זכוכית אובייקט </td><td> Marienfeld </td><td> זכוכית לבנה טהורה </td><td> הליך ניקוי מיוחד המשמש </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino נפטלין (laurdan) </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td></td><td> סמן פלורסנט (פתרון המלאי: 2 מ&quot;מ באתנול) </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1 Axioplan </tד&gt; <td></td></tr><tr><td> דיודת ליזר </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 עם הנהג PDL 800-B </td><td> אורך גל: 391 ננומטר </td></tr><tr><td> מערכת סיבי מצב יחידה </td><td> מקור פוינט </td><td> kineFlex </td><td> השתמשתי עם אופטיקה collimating </td></tr><tr><td> מצלמת EMCCD </td><td> תידור </td><td> DV887DC </td><td> מצלמה מוארת חזור </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

טופולוגיה פני שטח, למשל של גידול תאים על מצע, נקבעת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM). תאי מעובדות בשקופיות שקופות ודגרו במרקר זרחני המופץ הומוגנית בקרום הפלזמה שלהם. הארה מתרחשת על ידי קרן ליזר מקבילה, על פי זוויות משתנות של ההשתקפות הפנימית מוחלטת (TIR) ​​עם מעמקי חדירה שונים של השדה האלקטרומגנטי החולפים. הקלטה של ​​תמונות פלואורסצנציה על קרינה בכ 10 זוויות שונות מאפשרת לחשב מרחקי תא מצע עם דיוק של ננומטרים ספורים. הבדלים של הדבקה בין קווים שונים של תאים, תאים סרטניים ותאים למשל פחות ממאירים, נקבעים כך. בנוסף, שינויים אפשריים של הידבקות תא על כימי או טיפול פוטודינמי יכולים להיבחן. בהשוואה לשיטות אחרות של סופר רזולוצית חשיפה לאור מיקרוסקופיה נשמרהקטן מאוד, ולא נגרם ניזק של תאי חיים צפוי להתרחש.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...