Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
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धन ZAFH फोटॉन n, धन अनुसंधान अनुदान के लिए Bundesministerium für Bildung und (BMBF) नहीं Forschung के लिए लेखकों भूमि Baden-Württemberg और Europäische संघ Europäischer Fonds für मर regionale ENTWICKLUNG धन्यवाद. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 1792C08 Baden-Württemberg-Stiftung GmbH वित्तपोषण परियोजना &quot;Aurami&quot; के लिए.

1. प्रकोष्ठों सीडिंग ऊष्मायन <ol><li> बीज व्यक्ति की कोशिकाओं, जैसे - U373 एमजी या एक गिलास स्लाइड पर 100/2 मिमी कोशिकाओं का एक विशिष्ट घनत्व में U-251 एमजी glioblastoma कोशिकाओं और उन्हें संस्कृति के माध्यम में 4872 घंट?...

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

एक विधि नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ सेल सब्सट्रेट दूरी मापने के लिए वर्णित है. वर्तमान में, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के तरीकों, जैसे संरचित 7 रोशनी पर या एक अणु का पता लगाने के रूप में के रूप में ?...

जब एक प्रकाश अपवर्तक सूचकांक 1 n के एक माध्यम के माध्यम से प्रचार बीम अपवर्तक सूचकांक 2 n 2 मध्यम के लिए एक इंटरफेस मिलता &lt;1, कुल आंतरिक प्रतिबिंब घटना Θ के सभी कोण, जो महत्वपूर्ण कोण से अधिक कर रहे हैं पर होता है Θ ग = arcsin (2 n n / 1). घटना प्रकाश किरण पूरी तरह परिलक्षित बावजूद किया जा रहा है एक क्षणभंगुर विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र है कि मैं के अनुसार 2 मध्यम और अंतरफलक से लम्बवत दूरी z साथ तेजी decays में प्रवेश उदाहरण भी देते हैं (z) = मैं 0 ez / घ (Θ). मैं (z) विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र और घ (Θ) की तीव्रता तरंगदैर्ध्य λ में प्रवेश गहराई से मेल खाती है, के रूप में द्वारा दिए गए घ (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 2 पाप Θ - 2 n 2) / 2 -1 रूप में साहित्य 1,2 में सूचना दी, मैं 0 </sयूबी&gt; मैं ई संचरण कारक (Θ) टी और अनुपात n / 2 n 1 के साथ गुणा घटना के प्रकाश की तीव्रता से मेल खाती है. यदि इस प्रकाश बीम का बिजली क्षेत्र सदिश घटना के विमान (घटना और परिलक्षित बीम से फैला विमान यानी) polarized सीधा है, इस संचरण कारक द्वारा दिया जाता है (Θ) टी = 4 क्योंकि 2 / Θ [1 - 2 (2 n / nl 1)] TIRFM माप में पता लगाया प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए, प्रकाश अवशोषण नमूना के सभी परतों पर एकीकृत किया जा प्रतिदीप्ति मात्रा उपज η प्रासंगिक डाई के साथ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Ω का पता लगाने के ठोस कोण के साथ गुणा है. 3 के रूप में पहले से सूचना दी, इस तीव्रता से वर्णित किया जा सकता है मैं एफ (Θ) = (Θ OC) (z) में ई - z / घ (Θ) dz अगर सभी कारक हैं जो स्वतंत्र हैं च<html> रॉम घटना के कोण Θ और समन्वय z प्रयोगात्मक निरंतर ए 3 समीकरण में शामिल हैं analytically हल किया जा सकता है, अगर fluorophores की एकाग्रता ग (z) लगभग स्थिर हो जाता है - या तो सभी निर्देशांक z ≥ Δ, अंतरफलक से दूरी Δ होने कोशिकाओं के cytoplasm भीतर उदा. इस मामले में, अभिन्न z = Δ से z = जिसके परिणामस्वरूप ∞ में गणना की जा मैं एफ = ए सी टी (Θ घ) (Θ) / ई - Δ घ (Θ) - या z के बीच Δ = - टी / 2 और z / 2 = Δ + टी, यानी मोटाई टी की एक पतली परत के भीतर, उदाहरण के लिए एक सेल Δ अंतरफलक से एक दूरी पर स्थित झिल्ली. इस मामले में, प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में गणना की जा सकती है मैं एफ = ए सी टी (Θ) / ते Δ घ (Θ), अगर Δ के साथ तुलना में छोटा है. ent समीकरण (4) और (5) सेल सब्सट्रेट दूरी से &quot;&gt; Δ गणना की जा सकती है, अगर प्रतिदीप्ति तीव्रता मैं एफ की छवियों चर कोण के लिए दर्ज कर रहे हैं Θ, और अगर ln (मैं एफ / टी) (4 Eq.) या ln (मैं एफ / टी) (5 Eq.) इन कोण के लिए 1 / घ के एक समारोह के रूप में मूल्यांकन किया जाता है झिल्ली मार्कर इस कागज में इस्तेमाल किया laurdan (एस नीचे) के लिए मूल्यांकन 5 Eq. अनुसार किया गया था. 3, छवि अधिग्रहण के रूप में पहले से सूचना दी और मूल्यांकन की आवश्यकता है नमूने पर उत्तेजना प्रकाश के समरूप वितरण, - एक मॉडल 2 परत (अपवर्तक सूचकांक n substrate और cytoplasm के लिए 1 और 2 n के साथ क्रमशः) की वैधता. यह रखती है, अगर प्लाज्मा झिल्ली बहुत पतली है, और अगर बाह्य मध्यम (सेल और सब्सट्रेट के बीच) की परत घटना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य की तुलना में छोटा है. इसके अलावा, एक उदारवादी संख्यात्मक एपर्चर(आमतौर पर एक 0.90 ≤) खुर्दबीन उद्देश्य लेंस की चमक के ढांकता हुआ इंटरफ़ेस के निकट क्षेत्र में विचलन के विकिरण की anisotropy के कारण से बचने के लिए फायदेमंद है.

<table border="1"><tbody><tr><td> नाम </td><td> कंपनी </td><td> टाइप </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> इनक्यूबेटर </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> लामिना का प्रवाह </td><td> सुरक्षित Holten </td><td> S2010 1.2 एन GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> खेती मध्यम </td></tr><tr><td> ग्लास वस्तु स्लाइड </td><td> Marienfeld </td><td> शुद्ध सफेद कांच </td><td> विशेष सफाई प्रक्रिया का इस्तेमाल किया </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino नेफ़थलीन (laurdan) </td><td> आणविक जांच </td><td></td><td> मार्कर फ्लोरोसेंट (स्टॉक समाधान: इथेनॉल में 2 मिमी) </td></tr><tr><td> माइक्रोस्कोप </td><td> कार्ल Zeiss </td><td> 1 Axioplan </td&gt; <td></td></tr><tr><td> लेजर डायोड </td><td> PicoQuant </td><td> ड्राइवर PDL 800-B के साथ 400 LDH </td><td> वेवलेंथ: 391 एनएम </td></tr><tr><td> एकल मोड फाइबर प्रणाली </td><td> प्वाइंट स्रोत </td><td> kineFlex </td><td> Collimating प्रकाशिकी के साथ प्रयुक्त </td></tr><tr><td> EMCCD कैमरे </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> वापस प्रबुद्ध कैमरा </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

भूतल टोपोलॉजी, एक सब्सट्रेट पर बढ़ कोशिकाओं जैसे, चर कोण कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (VA-TIRFM) परिशुद्धता के साथ नैनोमीटर निर्धारित किया जाता है. कोशिकाओं पारदर्शी स्लाइड पर खेती की जाती है और एक फ्लोरोसेंट homogeneously अपने प्लाज्मा झिल्ली में वितरित मार्कर के साथ incubated. क्षणभंगुर विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र के विभिन्न प्रवेश गहराई के साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) ​​के चर कोण के तहत एक समानांतर लेजर बीम रोशनी के द्वारा होता है. प्रतिदीप्ति छवियों की रिकॉर्डिंग के बारे में 10 विभिन्न कोणों पर विकिरण पर नैनोमीटर कुछ के एक परिशुद्धता के साथ सेल सब्सट्रेट दूरी की गणना करने के लिए परमिट. विभिन्न सेल लाइनों, जैसे कैंसर कोशिकाओं और कम घातक कोशिकाओं आसंजन के बीच का अंतर इस प्रकार निर्धारित कर रहे हैं. इसके अलावा, रासायनिक या photodynamic उपचार पर कोशिका आसंजन संभव परिवर्तनों की जांच की जा सकती है. माइक्रोस्कोपी प्रकाश जोखिम सुपर संकल्प के अन्य तरीकों के साथ तुलना में रखा जाता हैजीवित कोशिकाओं का बहुत छोटा है, और कोई नुकसान होने की उम्मीद है.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

एक सब्सट्रेट पर कोशिका आसंजन की टोपोलॉजी चर कोण कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (VA-TIRFM) द्वारा नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ मापा जाता है.

कोशिका आसंजन की चर कोण कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (VA-TIRFM) पर Nanotopology

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

प्रांतस्था संगठन और गतिशीलता के सूक्ष्मजीवों में दृश्य, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग सेल प्रवासन के लिए चिपकने वाला और घुलनशील Gradients बनाना

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

ख्यात कोशिका आसंजन अणुओं की विशेषता के लिए मनका एकत्रीकरण Assays

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रिसेप्टर गतिशीलता के उच्च संकल्प Spatiotemporal विश्लेषण

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

एक संशोधित दो photon माइक्रोस्कोप में 3 डी कक्षीय ट्रैकिंग: Intracellular vesicles की ट्रैकिंग के लिए एक आवेदन

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप में लाइव कोशिका झिल्ली पर आण्विक प्रसार कानून को फास्ट प्रतिदीप्ति इमेजिंग से

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

के लिए एक उपकरण के रूप में एक लिपोसोमल-समझाया पास अवरक्त की fluorophore प्रतिदीप्ति शमन<em&gt; Vivo</em&gt; ऑप्टिकल इमेजिंग

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

मैट्रिक्स संशोधन द्वारा प्रेरित सेलुलर आसंजन और डी-आसंजन में वास्तविक समय परिवर्तन को मापने के लिए सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation साथ Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (BiFC-पाम)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar पर एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी bilayers समर्थित

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...