Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
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Gli autori ringraziano il Land Baden-Württemberg e l&#39;Unione-Europäischer Europäische Fonds für die Entwicklung regionale - per il finanziamento ZAFH PHOTON-n, il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) per assegno di ricerca finanziamento n. 1792C08 così come il Baden-Württemberg-Stiftung GmbH per il finanziamento del progetto &quot;Aurami&quot;.

1. Semina ed incubazione di cellule <ol><li> Seme singole cellule, per es U373-MG o U-251-MG cellule di glioblastoma ad una densità tipica di 100 cellule / mm 2 su un vetrino e farle crescere per 4872 ore in terreno di coltura (per es RPMI 1640 integrato con 10% siero di vitello fetale e antibiotici) utilizzando un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Incubare le cellule con un marcatore di membrana, per esempio 6-dodecanoile dimetilammino-2-naftalene (laurdan)...

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

Un metodo è descritto per cella di misura-substrato distanze con precisione nanometrica. Attualmente, i metodi di super-risoluzione microscopia, ad esempio sulla base di illuminazione strutturata 7 o 8-10 singoli rilevazione molecola nonché deplezione emissione stimolata (STED) microscopia 11 sono di notevole interesse. Nessuna di queste tecniche, tuttavia, consente una risoluzione assiale inferiore a 50 nm. Inoltre, irradianza piuttosto elevato di 50.100 W / cm 2 ?...

Quando un fascio di luce che si propaga attraverso un mezzo di indice di rifrazione n 1 incontra un&#39;interfaccia ad un secondo mezzo di rifrazione n 2 &lt;n 1, riflessione interna totale avviene a tutti gli angoli di incidenza Θ, che sono maggiore dell&#39;angolo critico Θ = c arcsin (n 2 / n 1). Nonostante sia totalmente riflesso del fascio di luce incidente evoca un campo evanescente elettromagnetico che penetra nel secondo mezzo e decade esponenzialmente con la distanza z perpendicolare dall&#39;interfaccia secondo I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) corrisponde all&#39;intensità del campo elettromagnetico e d (Θ) alla profondità di penetrazione alla lunghezza d&#39;onda λ, come indicato da d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Come riportato in letteratura 1,2, I 0 </sub&gt; corrisponde all&#39;intensità della luce incidente I e moltiplicato per il coefficiente di trasmissione T (Θ) e il rapporto n 2 / n 1. Se il vettore di campo elettrico di questo fascio di luce polarizzata è perpendicolare al piano di incidenza (cioè il piano attraversato dal incidente e il raggio riflesso), questo fattore di trasmissione è data dalla T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (2 n / NL 1) 2] Per l&#39;intensità di fluorescenza rilevata in misurazioni TIRFM, assorbimento di luce deve essere integrati su tutti gli strati del campione e moltiplicato per il rendimento η quantica di fluorescenza del colorante rilevante e con l&#39;angolo solido di rilevamento Ω. Come riportato in precedenza 3, questa intensità può essere descritto da I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz se tutti i fattori che sono indipendenti f<html> rom l&#39;angolo di incidenza e Θ coordinata z sono inclusi nella equazione sperimentale A. costante 3 può essere risolto analiticamente, se la concentrazione c (z) di fluorofori è considerato essere quasi costante - O affatto coordinate z ≥ Δ, ad esempio all&#39;interno del citoplasma delle cellule aventi una distanza Δ dall&#39;interfaccia. In questo caso, l&#39;integrale deve essere calcolata da z = Δ per z = ∞ conseguente I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - O tra z = Δ - t / 2 e z = + Δ t / 2, ossia in un sottile strato di spessore t, ad esempio una membrana cellulare a una distanza Δ dall&#39;interfaccia. In questo caso, l&#39;intensità di fluorescenza può essere calcolato come I F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), se t è piccolo in confronto con Δ. ent &quot;&gt; dalle equazioni (4) e (5) cellula-substrato distanze Δ può essere calcolato, se le immagini di fluorescenza I F sono registrati per angoli variabili Θ, e se ln (I F / T d) (Eq. 4) o ln (I F / T) (Eq. 5) viene valutato come una funzione di 1 / d per questi angoli. Per la membrana marcatore laurdan impiegate in questo documento (vedi sotto), la valutazione è stata eseguita secondo l&#39;Eq. 5. Come riportato in precedenza 3, l&#39;acquisizione delle immagini e la valutazione richiede - Distribuzione omogenea della luce di eccitazione sul campione, - Validità di un 2-strato del modello (con gli indici di rifrazione n 1 e n 2 per il substrato e il citoplasma, rispettivamente). Ciò vale, se la membrana plasmatica è molto sottile, e se il livello del mezzo extracellulare (tra la cella e il substrato) è piccolo rispetto alla lunghezza d&#39;onda della luce incidente. Inoltre, un&#39;apertura numerica moderata(Tipicamente A ≤ 0,90) della lente di obiettivo microscopio è vantaggioso per evitare deviazioni di luminosità dovuta alla anisotropia della radiazione nel campo vicino dell&#39;interfaccia dielettrico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Tipo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> A flusso laminare </td><td> Holten sicuro </td><td> S2010 1.2 IT GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% di penicillina / streptomicina </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Coltivazione media </td></tr><tr><td> Vetro oggetto diapositive </td><td> Marienfeld </td><td> Pure vetro bianco </td><td> Pulizia Procedura speciale utilizzato </td></tr><tr><td> 6-dodecanoile dimetilammino-2-naftalene (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marcatore fluorescente (soluzione stock: 2 mM in etanolo) </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Diodo laser </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 con autista PDL 800-B </td><td> Lunghezza d&#39;onda: 391 nm </td></tr><tr><td> Singola modalità del sistema di fibra </td><td> Punto di Origine </td><td> kineFlex </td><td> Usato con ottiche collimanti </td></tr><tr><td> EMCCD fotocamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Fotocamera posteriore illuminato </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Topologia superficiale, ad esempio di cellule che crescono su un substrato, è determinata con precisione nanometrica Variable-Angle Microscopy Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM). Cellule sono coltivate su vetrini trasparenti ed incubate con un marcatore fluorescente omogeneamente distribuiti nella loro membrana plasmatica. L&#39;illuminazione avviene mediante un raggio laser parallelo sotto angoli variabili di riflessione interna totale (TIR) ​​con differenti profondità di penetrazione del campo elettromagnetico evanescente. Registrazione di immagini di fluorescenza upon irradiazione a circa 10 diverse angolazioni permette di calcolare cellula-substrato distanze con una precisione di pochi nanometri. Differenze di adesione tra varie linee cellulari, cellule tumorali e cellule es meno maligne, sono così determinato. Inoltre, eventuali modifiche di adesione cellulare su di trattamento chimico o fotodinamica può essere esaminato. In confronto con altri metodi di super-risoluzione microscopia luce di esposizione rimanedanni molto piccola, e non di cellule viventi ci si aspetta.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologia di adesione cellulare su un substrato viene misurata con precisione nanometrica variabile-angolo microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (VA-TIRFM).

Nanotopology dell&#39;adesione cellulare su angolo di inclinazione variabile Microscopia Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Ricerca

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Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

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Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

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Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

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3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

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Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

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