Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
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著者らは、土地、バーデン·ヴュルテンベルク州とアオイ連合ユーロぺフォンエリーゼのためダイエオリエEntwicklungに感謝-資金ZAFH光子N、無資金研究助成金のためにエリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung（BMBF）のために。 1792C08ならびにプロジェクト &quot;Auramiを&quot;資金調達のためのバーデン·ヴュルテンベルク·財団社。

1。細胞の播種およびインキュベーション<ol><li>シード個々の細胞、 例えば U373-MGまたはU-251-MGの神経膠芽腫細胞をスライドガラス上に100細胞/ mm 2の典型的な密度にする（ 例えば RPMI-1640、10％ウシ胎児血清を添加した培地中で4872時間のためにそれらを育てると抗生物質）で37℃、5％CO 2のインキュベーターを用いた。 </li><li> 8μM（培地中の）4、または細?...

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. 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メソッドは、ナノメートルの精度で細胞 - 基質間の距離を測定するために記述されている。現在、 例えば構造化照明7または単一分子検出8-10と同様に誘導放出の枯渇に基づく超解像顕微鏡の方法、（STED）顕微鏡11は、かなりの関心が持たれている。これらの技術はいずれも、しかし、50 nm以下の軸方向の分解能を可能にしていません。また、50100 W / cm 2?...

屈折率n 1の媒質中を伝搬する光ビームが屈折率n 2の第2の媒質へのインターフェースを満たしたときに、&lt;nの1、全反射は、臨界角より大きい発生率Θのすべての角度で発生ΘC =アークサイン（N 2 / N 1）。全く反映されているにもかかわらず、入射光ビームは、I（Z）= I 0 EZ / D（Θ）に従ってインターフェイスから垂直距離zで指数関数的に減衰し、第二の媒体に浸透エバネセント電磁界を彷彿とさせます。で与えられるように私は（z）は、波長λにおける浸透深さに電磁場の強度に対応するとd（Θ） D（Θ）=（λ/4π）（N 1 2罪Θ2 - N 2）-1 / 2 文献1,2に報告されているように、私は0 </sUB&gt;は入射光の強度に対応して、私はeが透過率T（Θ）と比n 2 / nは1で乗算。この光の電場ベクトルが入射面（入射と反射ビームによって張ら平面をIE）に対して垂直に偏光である場合は、この透過率は次式で与えられます。 T（Θ）= 4 cosの2Θ/ [1 - （N 2 / NL 1）2] TIRFM測定で検出された蛍光強度は、光吸収は、サンプルのすべての層の上に統合されており、検出Ωの立体角と同様に、関連する色素の蛍光量子収率ηと乗算する必要があります。以前に3報告したように、この強度は次のように記述することができます I F（Θ）=（Θ）OC（z）での電子のz / D（Θ）DZ もし独立したfはすべての要因<html>蛍光色素の濃度c（z）はほぼ一定であるとみなされた場合ROM入射角Θと座標zは実験定数Aの式（3）内に含まれているが、解析的に解くことができます -いずれかのすべての座標のz≥Δ、界面からの距離Δを有する細胞の細胞質内に例えばで。この場合、積分はz =Δがために、Z =∞の結果から計算しなければならない 私はF = A C T（Θ）はD（Θ）のe-Δ/ D（Θ） -インタフェースから距離Δに位置するT / 2とz =Δ+ T / 2、厚さtの薄い層内すなわち 、 例えば細胞膜-またはz =Δの間。この場合、蛍光強度は次のように計算できます 私はF = A C T（Θ）TE-Δ/ D（Θ）は 、 トンはΔに比べて小さい場合。 ENT &quot;&gt;蛍光強度の画像は私がFを Θ、およびln IF可変角度（I、F / T d）は（式4）のために記録されている場合、式（4）及び（5）細胞-基質距離からΔは、計算することができます。またはLN（I、F / T）（式5）は、これらの角度の1 / dの関数として評価されます。本稿で用いる膜マーカーlaurdan（S.以下）については評価は式5に準じて行った。 画像収集と評価が必要では、以前に報告したように3 - サンプルの上に励起光の均一な分布、 - 2層モデルの妥当性（基質と細胞質の屈折率n 1とn 2と、それぞれ）。原形質膜が非常に薄い場合には、保持しており、細胞外培地（セルと基板との間）の層は、入射光の波長に比べて小さい場合。 加えて、適度な開口数（通常≤0.90）顕微鏡対物レンズのは、誘電体の界面近傍界での放射の異方性に起因する輝度のばらつきを避けるために有利である。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> タイプ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ヌンク</td><td>ヌンクCellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td>層流</td><td>セーフHolten </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM +10％FCS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> BIOCHROM </td><td></td><td>培養媒体</td></tr><tr><td>ガラスのオブジェクトのスライド</td><td> Marienfeld </td><td>純粋な白ガラス</td><td>使用される特殊なクリーニング手順</td></tr><tr><td> 6-ドデカノイル-2 - ジメチルナフタレン（laurdan） </td><td>分子プローブ</td><td></td><td>蛍光マーカー（ストック溶液：エタノールさ2mm） </td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> Axioplan 1 </tD&gt; <td></td></tr><tr><td>半導体レーザー</td><td> PicoQuant </td><td>ドライバのPDL 800-BとLDH 400 </td><td>波長：391 nmの</td></tr><tr><td>シングルモード光ファイバシステム</td><td>点光源</td><td> kineFlex </td><td>平行光学系と一緒に使用</td></tr><tr><td> EMCCDカメラ</td><td>アンドール</td><td> DV887DC </td><td>戻る照らさカメラ</td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

表面トポロジー、基板上に成長する細胞の例は 、可変アングル全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で決定されます。細胞は透明なスライド上で培養し、均一にそれらの形質膜に分布する蛍光マーカーと共にインキュベートする。照明はエバネセント電磁界の様々な侵入深さを持つ内部全反射（TIR）の可変角度の下で平行レーザビームによって発生します。約10異なる角度で照射により蛍光画像の記録は、数ナノメートルの精度で細胞 - 基質の距離を計算することを可能にする。種々の細胞株、 例えばがん細胞と少ない悪性細胞との間の密着性の違いは、このように決定されています。また、化学的又は光線力学的治療の際の細胞接着の変化の可能性を調べることができます。超解像顕微鏡光曝露の他の方法と比較して保持されます生きている細胞の非常に小さい、無被害が発生することが予想されています。

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。

可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...