Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Forfatterne takker delstaten Baden-Württemberg og Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - for finansiering ZAFH-PHOTON n, den Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) for finansiering forskningsstipend no. 1792C08 samt Baden-Württemberg-Stiftung GmbH for finansieringen av prosjektet &quot;Aurami&quot;.

1. Såing og Inkubasjon av celler <ol><li> Seed individuelle celler, f.eks U373-MG eller U-251-MG glioblastoma celler på en typisk densitet på 100 celler / mm 2 på en glass-slide og vokse dem for 4872 hr i dyrkingsmedium (f.eks RPMI 1640 supplert med 10% kalvefosterserum og antibiotika) ved hjelp av en inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2. </li><li> Inkuber celler med en membran markør, f.eks 6-dodecanoyl-2-dimetylamino naftalen (laurdan) søkt i 60 min ved en konsentra...

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

En fremgangsmåte er beskrevet for å måle celle-substrat avstander med nanometerpresisjon. Dag, metoder for super-oppløsning mikroskopi, for eksempel basert på strukturert belysning 7 eller på eneste molekyl gjenkjenning 8-10 samt stimulert emisjon utarming (Schibsted) mikroskopi 11 er av betydelig interesse. Ingen av disse teknikkene, men tillater en aksial oppløsning under 50 nm. I tillegg ganske høy irradians av 50100 W / cm 2 er nødvendig for ett molekyl m...

Når en lysstråle forplanter seg gjennom et medium av brytningsindeks n 1 møter et grensesnitt til en andre medium av brytningsindeks n 2 &lt;n 1, oppstår total innvendig refleksjon i alle vinkler av insidens Θ, som er større enn den kritiske vinkelen Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Tross for å være helt reflektert hendelsen lysstrålen fremkaller en evanescent elektromagnetisk felt som trenger inn i det andre medium, og nedbrytes eksponentielt med vinkelrett avstand z fra grensesnittet ifølge I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) svarer til intensiteten av det elektromagnetiske feltet og d (Θ) til inntrengningsdybden på bølgelengde λ, som gis av d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 Sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Som rapportert i litteraturen 1,2, 0 I </sub&gt; svarer til intensiteten av innfallende lys jeg e multiplisert med transmittans T (Θ) og forholdet n 2 / n 1. Hvis den elektriske feltvektor i denne lysstrålen er polarisert vinkelrett på planet av insidensen (dvs. planet utspent av hendelsen og den reflekterte stråle), er denne gitt ved transmittans T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (N 2 / nL 1) 2] For det oppdagede fluorescensintensiteten i TIRFM målinger, har lys absorpsjon skal integreres over alle lag av prøven og multiplisert med fluorescens kvanteutbytte η av relevant fargestoff samt med den faste vinkel deteksjon Ω. Som rapportert tidligere 3, kan denne intensiteten beskrives ved I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz hvis alle faktorer som er uavhengige f<html> ROM innfallsvinkelen Θ og koordinatsystemet z er inkludert i den eksperimentelle konstant A. Likning 3 kan løses analytisk, dersom konsentrasjonen c (z) av fluoroforer anses å være nesten konstant - Enten på alle koordinater z ≥ Δ, f.eks i cytoplasma av celler som har en avstand Δ fra grensesnittet. I dette tilfellet, har integralet beregnes fra z = Δ til z = ∞ resulterer i I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Eller mellom z = Δ - t / 2 og z = Δ + t / 2, det vil si innenfor et tynt lag av tykkelse t, f.eks en cellemembran plassert i en avstand Δ fra grensesnittet. I dette tilfellet, kan den fluorescensintensiteten beregnes som I F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), hvis t er liten i forhold til Δ. ent &quot;&gt; Fra Likningene (4) og (5) celle-substrat avstander Δ kan beregnes, hvis bilder av fluorescensintensitet I F føres for variable vinkler Θ, og hvis ln (I F / T d) (Eq. 4) eller ln (I F / T) (Eq. 5) evalueres som en funksjon av 1 / d for disse vinkler. For membranen markør laurdan brukt i denne artikkelen (s. nedenfor) evalueringen ble utført i henhold til Eq. 5. Som rapportert tidligere 3, bildeopptak og evaluering krever - Homogen fordeling av eksitasjon lys over prøven, - Gyldigheten av et 2-lags-modellen (med brytningsindekser n 1 og n 2 for substratet og cytoplasma, henholdsvis). Dette holder, hvis plasmamembranen er svært tynn, og hvis lag av det ekstracellulære medium (mellom cellen og substratet) er liten sammenlignet med bølgelengden til innfallende lys. I tillegg, en moderat numerisk apertur(Vanligvis en ≤ 0,90) av mikroskopobjektivlinsehuset er fordelaktig å unngå avvik lysstyrke grunnet anisotropi av stråling i nærfeltet av den dielektriske grensesnittet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Selskapet </td><td> Type </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminær </td><td> Holten Sikker </td><td> S2010 1,2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% penicillin / streptomycin </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Dyrking medium </td></tr><tr><td> Glass objekt lysbilder </td><td> Marienfeld </td><td> Ren hvit glass </td><td> Spesiell rengjøring prosedyren brukes </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimetylamino naftalen (laurdan) </td><td> Molekylære prober </td><td></td><td> Fluoriserende fargestoff (Stamoppløsning: 2 mm i etanol) </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan en </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiode </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 med sjåfør PDL 800-B </td><td> Bølgelengde: 391 nm </td></tr><tr><td> Enkelmodusfiber system </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Brukes med kollimasjonsoptikk </td></tr><tr><td> EMCCD kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Tilbake opplyst kamera </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Overflaten topologien, f.eks av celler som vokser på et substrat, blir bestemt med nanometerpresisjon etter variabel vinkel total innvendig refleksjon fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM). Celler dyrkes på transparente lysbilder og inkubert med en fluorescerende markør homogent fordelt i deres plasmamembranen. Belysning skjer ved en parallell laserstråle under varierende vinkler av total innvendig refleksjon (TIR) ​​med ulike inntrengningsdybdene av den flyktige elektromagnetisk felt. Opptak av fluorescens bilder ved bestråling på ca 10 forskjellige vinkler tillater å beregne celle-substrat avstander med en presisjon på noen få nanometer. Forskjeller av vedheft mellom forskjellige cellelinjer, f.eks kreftceller og mindre ondartede celler, er således bestemt. I tillegg kan mulige endringer av celleadhesjon ved kjemiske eller fotodynamisk behandling undersøkes. I sammenligning med andre metoder for super-oppløsning mikroskopi lyseksponering holdessvært liten, og ingen skader av levende celler er forventet å oppstå.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologien av celleadhesjon på et substrat måles med nanometer presisjon av variabel vinkel total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM).

Nanotopology av celleadhesjon på Variable-Angle Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Perle aggregering Analyser for karakterisering av Antatte celleadhesjonsmolekyler

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivated Lokalisering Mikros med bimolecular fluorescens Komplemente (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...