Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
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Os autores agradecem o Land Baden-Württemberg e da Europäische União Europäischer Fonds für die Entwicklung regionale - para financiamento ZAFH-PHOTON n, o Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para financiamento da investigação concessão não. 1792C08 bem como a GmbH Baden-Württemberg-Stiftung para o financiamento do projeto &quot;Aurami&quot;.

1. Sementeira e incubação de células <ol><li> Semente de células individuais, por exemplo, U373-MG ou células U-251 MG-glioblastoma a uma densidade típica de 100 células / mm 2 sobre uma lâmina de vidro e crescê-los para 4872 horas em meio de cultura (por exemplo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e antibióticos), utilizando uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Incubar as células com um marcador de membrana, por exemplo, 6-d...

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. 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L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. 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É descrito um método para a medição de célula-substrato distâncias com uma precisão nanométrica. Presentemente, os métodos de resolução super-microscopia, por exemplo, com base na iluminação estruturada 7 ou em 8-10 de detecção de moléculas isoladas, assim como depleção emissão estimulada (STED) Microscopia 11 são de considerável interesse. Nenhuma destas técnicas, contudo, permite uma resolução axial inferior a 50 nm. Além disso, a irradiância bastante...

Quando um feixe de luz que se propaga através de um meio de índice de refracção n 1 encontra uma interface para um segundo meio de índice de refracção n 2 &lt;n 1, a reflexão interna total ocorre em todos os ângulos de incidência Θ, que são maiores do que o ângulo crítico Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Apesar de ter sido totalmente reflectido do feixe de luz incidente evoca um campo electromagnético evanescente que penetra no segundo meio e decai exponencialmente com a distância perpendicular a partir da interface de z de acordo com a I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) corresponde à intensidade do campo electromagnético e d (Θ) para a profundidade de penetração no comprimento de onda λ, como dada pela d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 2 Θ pecado - n 2 2) -1 / 2 Conforme relatado na literatura 1,2, I 0 </sub&gt; corresponde à intensidade da luz incidente I e multiplicada com o factor de transmissão T (Θ) e a relação de n 2 / n 1. Se o vector do campo eléctrico do feixe de luz é perpendicular ao plano de polarização da incidência (isto é, o plano gerado pelo incidente e do feixe reflectido), este factor de transmissão é dada pela T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Para a intensidade de fluorescência detectada no TIRFM medições, a absorção de luz tem de ser integrado ao longo de todas as camadas da amostra e multiplicado com o rendimento quântico de fluorescência do corante η relevantes, bem como com o ângulo sólido de detecção Ω. Como relatado anteriormente 3, esta intensidade pode ser descrita pela Eu F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz se todos os fatores que são f independente<html> rom o ângulo de incidência e do Θ z coordenadas estão incluídos dentro da Equação A. experimental constante 3 pode ser resolvido analiticamente, se a concentração c (z) de fluoróforos é considerado para ser quase constante - Quer no todo z ≥ Δ coordenadas, por exemplo, dentro do citoplasma das células com uma distância Δ partir da interface. Neste caso, a integral tem de ser calculada a partir de z = Δ para z = ∞ resultando Eu F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Ou entre z = Δ - t / 2 e z = Δ + t / 2, ou seja, dentro de uma fina camada de espessura t, por exemplo, uma membrana celular, localizado a uma distância a partir da interface Δ. Neste caso, a intensidade de fluorescência pode ser calculado como Eu F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), se t é pequeno em comparação com Δ. &gt; ent &quot;A partir das Equações (4) e (5) da célula-substrato distâncias Δ pode ser calculado, se as imagens de intensidade de fluorescência, F I são registados por ângulos variáveis ​​Θ, e se ln (I F / T d) (Eq. 4) ou ln (I F / T) (Eq. 5) é avaliada como uma função de 1 / d para esses ângulos. Para a membrana laurdan marcador utilizado no presente documento (s. abaixo), a avaliação foi realizada de acordo com a Equação 5.. Como relatado anteriormente 3 de aquisição de imagem, e requer a avaliação - Distribuição homogênea da luz de excitação sobre a amostra, - A validade de um modelo de 2-camadas (com os índices de refracção n 1 e n 2 para o substrato e do citoplasma, respectivamente). Isto aplica-se a membrana do plasma é muito fina e, se a camada do meio extracelular (entre a célula e o substrato) é pequeno em comparação com o comprimento de onda da luz incidente. Além disso, a abertura de uma moderada numérica(Tipicamente 0,90 ≤ A) da lente da objectiva do microscópio é vantajosa para evitar desvios de brilho devido a anisotropia da radiação no domínio próximo da interface dielétrico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Tipo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Fluxo laminar </td><td> Holten Seguro </td><td> S2010 1,2 PT GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Meio de cultura </td></tr><tr><td> Objeto lâminas de vidro </td><td> Marienfeld </td><td> Vidro branco puro </td><td> Procedimento de limpeza especial usado </td></tr><tr><td> 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marcador fluorescente (solução de armazém: 2 mM em etanol) </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Diodo laser </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 com motorista PDL 800-B </td><td> Comprimento de onda: 391 nm </td></tr><tr><td> Sistema de fibra monomodo </td><td> Fonte ponto </td><td> kineFlex </td><td> Usado com óptica de colimação </td></tr><tr><td> Câmera EMCCD </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Câmera traseira iluminada </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Topologia de superfície, por exemplo, que as células crescem sobre um substrato, é determinada com uma precisão nanométrica por Variable Angle-Fluorescence Microscopy Internal Reflection total (TIRFM-VA). As células são cultivadas em lâminas transparentes e incubaram-se com um marcador fluorescente homogeneamente distribuídos na sua membrana plasmática. Iluminação ocorre por um feixe de laser paralelo sob um ângulo variável de reflexão interna total (TIR), com diferentes profundidades de penetração do campo electromagnético evanescente. A gravação de imagens de fluorescência após irradiação a cerca de 10 diferentes ângulos permite calcular distâncias célula-substrato, com uma precisão de alguns nanómetros. As diferenças de adesão entre as linhas de células diferentes, por exemplo, células cancerosas e células malignas, menos são assim determinados. Além disso, as variações possíveis de adesão das células mediante tratamento químico ou fotodinâmica pode ser examinado. Em comparação com outros métodos de super-resolução de exposição de microscopia de luz é mantidadanos muito pequena, e não de células vivas é de esperar a ocorrência.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologia de adesão celular num substrato é medida com uma precisão nanométrica de ângulo variável por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-VA).

Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Bioengenharia

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

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In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...