Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Авторы благодарят земли Баден-Вюртемберг и Europäische Союз-Europäischer Fonds für умереть Региональный Entwicklung - для финансирования ZAFH-ФОТОН п, Bundesministerium für Bildung унд Forschung (BMBF) для финансирования гранта нет. 1792C08 а также Baden-Württemberg-Stiftung GmbH для финансирования проекта &quot;Aurami&quot;.

1. Посев и инкубация клеток <ol><li> Семенной отдельных клеток, например, U373-MG или U-251-MG клетки глиобластомы при типичной плотностью 100 клеток / мм 2 на предметное стекло и выращивать их для 4872 часов в культуральной среде (например, RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей ...

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

Описан метод измерения клетки с субстратом расстояния с нанометровой точностью. В настоящее время методы супер-разрешение микроскопа, например, на основе структурированной подсветки 7 или на одну молекулу обнаружения 8-10, а также вынужденное излучение истощения (STED) ми...

Когда луч света, распространяющегося через среду с показателем преломления п 1 соответствует интерфейс для второй среде с показателем преломления п 2 &lt;N 1, полное внутреннее отражение происходит на всех углах падения Θ, которая больше, чем критический угол Θ с = агсзш (N 2 / N 1). Несмотря на полное отражение падающего света вызывает затухающих электромагнитных полей, который проникает во вторую среду и убывает экспоненциально с перпендикулярной расстоянии г от интерфейса в соответствии с I (г) = I 0-эз / D (Θ). Я (г) соответствует интенсивности электромагнитного поля и D (Θ) с глубиной проникновения на длине волны λ, определяемый D (Θ) = (λ/4π) (п 1 2 грехов 2 Θ - N 2 2) -1 / 2 Как сообщалось в литературе, 1,2, I 0 </sUB&gt; соответствует интенсивности падающего света I электронной умножается на коэффициент пропускания T (Θ) и соотношение N 2 / N 1. Если вектор напряженности электрического поля этой световой луч поляризован перпендикулярно плоскости падения (т.е. плоскости, натянутой на падающий и отраженный луч), этот коэффициент передачи определяется T (Θ) = 4 соз 2 Θ / [1 - (N 2 / NL 1) 2] Для обнаружены интенсивности флуоресценции в TIRFM измерений, поглощение света должно быть интегрировано над всеми слоями образца и умножается на квантовый выход флуоресценции η соответствующих красителей, а также с твердым угол обнаружения Ω. Как сообщалось ранее 3, эта интенсивность может быть описан Я F (Θ) = AT (Θ) ° С (г) е-Z / D (Θ) йг если все факторы, которые не зависят F<html> ROM от угла падения Θ и координаты г, включены в экспериментальную постоянной Уравнение A. 3 может быть решена аналитически, если концентрация с (г) флуорофоров они считаются почти постоянной - Либо вообще координат г ≥ Δ, например, в цитоплазме клетки, имеющие расстояние Δ от интерфейса. В этом случае интеграл должен быть рассчитана г = Δ для г = ∞ в результате I F = C T (Θ) D (Θ) E-Δ / D (Θ) - Или между г = Δ - т / 2 и Z = Δ + т / 2, т. е. в тонком слое толщиной т, например, клеточные мембраны расположены на расстоянии Δ от интерфейса. В этом случае интенсивность флуоресценции может быть рассчитана как I F = C T (Θ) тэ-Δ / D (Θ), Если Т мала по сравнению с Δ. ENT &quot;&gt; Из уравнений (4) и (5) клетки с субстратом расстояния Δ может быть рассчитана, если изображение интенсивности флуоресценции I F записываются для переменными углами Θ, а если п (I F / T г) (уравнение 4) или п (I F / T) (формула 5) вычисляется как функция 1 / сут в течение этих углов. Для мембранных маркеров лаурдана используемые в этой статье (ст. ниже) оценка была выполнена в соответствии с формулой. 5. Как сообщалось ранее 3, получения изображений и оценки требуется - Равномерное распределение света возбуждения по образцу, - Срок действия 2-х слойной модели (с показателями преломления N 1 и N 2 к подложке и цитоплазмы, соответственно). Это справедливо, если плазма мембрана очень тонкая, и если слой внеклеточной среде (между клеткой и подложкой) мала по сравнению с длиной волны падающего света. Кроме того, умеренное числовой апертурой(Обычно ≤ 0,90) от объектива микроскопа выгодно, чтобы избежать отклонения яркости из-за анизотропии излучения в ближнем поле диэлектрик.

<table border="1"><tbody><tr><td> Имя </td><td> Компания </td><td> Тип </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Инкубатор </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Ламинарный поток </td><td> Holten безопасной </td><td> S2010 1,2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% пенициллина / стрептомицина </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Выращивание среднего </td></tr><tr><td> Предметные стекла объекта </td><td> Marienfeld </td><td> Чистый белый стекло </td><td> Специальная процедура очистки использовали </td></tr><tr><td> 6-додеканоил-2-диметиламино нафталина (лаурдана) </td><td> Молекулярные зонды </td><td></td><td> Флуоресцентные метки (раствор: 2 мм в этаноле) </td></tr><tr><td> Микроскоп </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </tD&gt; <td></td></tr><tr><td> Лазерный диод </td><td> PicoQuant </td><td> ЛДГ 400 с драйвером PDL 800-B </td><td> Длина волны: 391 нм </td></tr><tr><td> Единая система одномодового оптоволокна </td><td> Точечный источник </td><td> kineFlex </td><td> Используется с коллимирующей оптикой </td></tr><tr><td> EMCCD камеры </td><td> Андор </td><td> DV887DC </td><td> Вернуться освещенной камере </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Топологию поверхности, например, клеток, растущих на подложке, определяется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM). Клетки культивируются на прозрачных слайдов и инкубировали с флуоресцентным маркером равномерно распределены в их плазматической мембраны. Освещение происходит путем параллельного пучка лазера при переменным углом полного внутреннего отражения (ПВО) с различной глубиной проникновения затухающих электромагнитных полей. Запись флуоресцентных изображений при облучении около 10 различных углов позволяет рассчитывать клетки с субстратом расстояния с точностью до нескольких нанометров. Различия адгезии между различными клеточными линиями, например, раковых клеток и менее злокачественных клеток, таким образом, определена. Кроме того, возможны изменения клеточной адгезии при химическом или фотодинамической терапии могут быть рассмотрены. По сравнению с другими методами супер-разрешение воздействия световой микроскопии сохраняетсяочень маленький, и без повреждения живых клеток, как ожидается, произойдет.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Топология адгезии клеток на подложке измеряется с нанометровой точностью переменным углом полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (VA-TIRFM).

Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Бусы агрегации Анализы для характеристики Предполагаемые клеточной адгезии молекул

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для<em&gt; В Vivo</em&gt; Оптических изображений

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Фотоактивированные Локализация микроскопия с Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...