Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
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Los autores agradecen el Estado federado de Baden-Württemberg y la Europäische Union Europäischer-Fonds für die Entwicklung regionale - para la financiación ZAFH-PHOTON n, el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para la financiación de la investigación subvención no. 1792C08, así como la GmbH Baden-Württemberg-Stiftung para la financiación del proyecto &quot;Aurami&quot;.

1. Siembra y la incubación de células <ol><li> Se siembran las células individuales, por ejemplo U373-MG o U-251-MG células de glioblastoma a una densidad típica de 100 células / mm 2 sobre un portaobjetos de vidrio y crecer para 4872 hr en medio de cultivo (por ejemplo, RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal y antibióticos), utilizando una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Se incuban las células con un marcador de membrana, por ejemplo, 6...

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. 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L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. 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Se describe un método para la medición de distancias en el sustrato de células con una precisión nanométrica. En la actualidad, los métodos de microscopia de super-resolución, por ejemplo, sobre la base de iluminación estructurada 7 o en un solo 8-10 moléculas de detección, así como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía 11 son de considerable interés. Ninguna de estas técnicas, sin embargo, permite una resolución axial por debajo de 50 nm. Ad...

Cuando un haz de luz que se propaga a través de un medio de índice de refracción n 1 cumple una interfaz a un segundo medio de índice de refracción n 2 &lt;n 1, la reflexión interna total se produce en todos los ángulos de incidencia Θ, que son mayores que el ángulo crítico c = Θ arcsen (n 2 / n 1). A pesar de estar totalmente reflejada del haz de luz incidente evoca un campo electromagnético evanescente que penetra en el segundo medio y decae exponencialmente con la distancia perpendicular z desde la interfaz de acuerdo a I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) corresponde a la intensidad del campo electromagnético y d (Θ) a la profundidad de penetración en la longitud de onda λ, como se da d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sen 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Como se informó en la literatura 1,2, I 0 </sub&gt; corresponde a la intensidad de luz incidente I e multiplica por el factor de transmisión T (Θ) y la relación n 2 / n 1. Si el vector de campo eléctrico de este haz de luz es polarizada perpendicular al plano de incidencia (es decir, el plano generado por el incidente y el rayo reflejado), este factor de transmisión está dada por T (Θ) = 4 cos Θ 2 / [1 - (2 n / nL 1) 2] Por la intensidad de fluorescencia detectada en mediciones TIRFM, absorción de la luz tiene que ser integrado en todas las capas de la muestra y multiplicado con el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante η pertinente, así como con el ángulo sólido de detección Ω. Como se informó previamente 3, esta intensidad puede ser descrito por I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz si todos los factores que son independientes f<html> rom el ángulo de incidencia Θ y la coordenada z se incluyen dentro de la ecuación experimental A. constante 3 se pueden resolver analíticamente, si la concentración de c (z) de los fluoróforos se considera que es casi constante - Bien en todas las coordenadas z ≥ Δ, por ejemplo, en el citoplasma de las células que tienen una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la integral tiene que ser calculado de z = Δ para z = ∞ resulta en I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - O entre z = Δ - t / 2 y z = Δ + t / 2, es decir, dentro de una capa fina de espesor t, por ejemplo, una membrana de célula que se encuentran a una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la intensidad de fluorescencia puede ser calculada como I F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), si t es pequeño en comparación con Δ. ent &quot;&gt; De las ecuaciones (4) y (5) las distancias sustrato de células-Δ se puede calcular, si las imágenes de la intensidad de fluorescencia I F se registran para ángulos variables Θ, y si ln (I F / T d) (Ec. 4) o ln (I F / T) (Ec. 5) se evalúa como una función de 1 / d para estos ángulos. Para la membrana marcador laurdan utiliza en este documento (s. a continuación) la evaluación se realizó de acuerdo a la ecuación. 5. Como se informó anteriormente 3, adquisición de imágenes y requiere una evaluación - Distribución homogénea de la luz de excitación sobre la muestra, - Validez de un modelo 2-capa (con los índices de refracción N 1 y N 2 para el sustrato y el citoplasma, respectivamente). Esto es, si la membrana plasmática es muy delgada, y si la capa del medio extracelular (entre la célula y el sustrato) es pequeño comparado con la longitud de onda de la luz incidente. Además, una apertura numérica moderada(Típicamente un 0,90 ≤) de la lente objetivo del microscopio es ventajoso para evitar desviaciones de brillo debido a la anisotropía de la radiación en el campo cerca de la interfaz dieléctrico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Tipo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Flujo laminar </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de penicilina / estreptomicina </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Cultivo medio </td></tr><tr><td> Diapositivas de vidrio objeto </td><td> Marienfeld </td><td> Vidrio blanco puro </td><td> Procedimiento de limpieza especial utilizado </td></tr><tr><td> 6-dodecanoil-2-dimetilamino naftaleno (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marcador fluorescente (solución madre: 2 mM en etanol) </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Láser diodo </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 con controlador PDL 800-B </td><td> Longitud de onda: 391 nm </td></tr><tr><td> Modo simple sistema de fibra </td><td> Punto de Origen </td><td> kineFlex </td><td> Se utiliza con la óptica de colimación </td></tr><tr><td> EMCCD cámara </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Cámara trasera iluminada </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Topología de la superficie, por ejemplo de células que crecen sobre un sustrato, se determina con una precisión nanométrica de ángulo variable total Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna (VA-TIRFM). Las células se cultivan en portaobjetos transparentes y se incubaron con un marcador fluorescente distribuido homogéneamente en su membrana plasmática. Iluminación se produce mediante un rayo láser paralelo bajo ángulos variables de reflexión interna total (TIR) ​​con diferentes profundidades de penetración del campo electromagnético evanescente. Grabación de imágenes de fluorescencia tras la irradiación en alrededor de 10 diferentes ángulos permite calcular distancias sustrato celular con una precisión de unos pocos nanómetros. Las diferencias de adhesión entre las distintas líneas celulares, por ejemplo células cancerosas y las células malignas, son menos así determinada. Además, los posibles cambios de la adhesión celular a un tratamiento químico o fotodinámica puede ser examinado. En comparación con otros métodos de super-resolución exposición microscopía de luz se mantienedaño muy pequeño, y no de las células vivas se espera que ocurra.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topología de la adhesión celular sobre un sustrato se mide con una precisión nanométrica de ángulo variable total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM).

Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigación

Bioingeniería

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...