Name: nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Författarna tackar delstaten Baden-Württemberg och Europäische Union-Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - för finansiering ZAFH-photon n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) för finansiering forskningsanslag nej. 1792C08 samt Baden-Württemberg-Stiftung GmbH för att finansiera projektet &quot;Aurami&quot;.

1. Sådd och inkubering av celler <ol><li> Seed individuella celler, t.ex. U373-MG eller U-251-MG-celler glioblastom vid en typisk densitet av 100 celler / mm 2 på en glasskiva och odla dem för 4872 timmar i odlingsmedium (t.ex. RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum och antibiotika) med användning av en inkubator vid 37 ° C och 5% COj 2. </li><li> Inkubera cellerna med ett membran markör, t.ex. 6-dodekanoyl-2-dimetylamino-naftalen (laurdan) tillämpas fö...

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

En metod beskrivs för att mäta cell-substrat avstånd med nanometer precision. För närvarande metoder för super-upplösning mikroskopi, t.ex. baserade på strukturerade belysningen 7 eller på enstaka molekyl upptäckt 8-10 samt stimulerad emission utarmning (Sted) mikroskopi 11 är av stort intresse. Ingen av dessa tekniker tillåter emellertid en axiell upplösning under 50 nm. Dessutom W / cm 2 ganska hög irradians av 50.100 behövs för enda molekyl metoder ...

När en ljusstråle som utbreder sig genom ett medium av brytningsindex n 1 möter ett gränssnitt till ett andra medium med brytningsindex n 2 &lt;n 1, sker total inre reflektion vid alla infallsvinklar Θ, som är större än den kritiska vinkeln Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Trots att totalreflekteras den infallande ljusstrålen framkallar ett evanescent elektromagnetiskt fält som tränger in i den andra mediet och sönderfaller exponentiellt med vinkelräta avståndet z från gränsytan enligt I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) motsvarar intensiteten hos det elektromagnetiska fältet och d (Θ) till inträngningsdjupet vid våglängden λ, som ges av d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Som rapporterats i litteraturen 1,2, 0 jag </sub&gt; motsvarar intensiteten hos infallande ljus jag e multiplicerat med transmissionen faktor T (Θ) och förhållandet N 2 / N 1. Om den elektriska fältvektorn av denna ljusstråle är polariserat vinkelrätt mot infallsplanet (dvs. planet överbryggas av den infallande och den reflekterade strålen), är denna överföring faktor ges av T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (N 2 / nL 1) 2] För den detekterade fluorescensintensiteten i TIRFM mätningar, måste Ijusabsorption ska integreras över alla skikten i provet och multipliceras med fluorescens kvantutbytet η av den relevanta färgämnet liksom med den fasta vinkeln för detektering Ω. Som tidigare rapporterats 3, kan denna intensitet beskrivas genom I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz om alla faktorer som är oberoende f<html> rom infallsvinkeln Θ och koordinaten z ingår i den experimentella konstanta A. Ekvation 3 kan lösas analytiskt, om koncentrationen C (Z) av fluoroforer anses vara nästan konstant - Antingen vid alla koordinater z ≥ Δ, t.ex. inom cytoplasman i celler som har ett avstånd Δ från gränsytan. I detta fall, måste integralen beräknas från z = Δ till z = ∞ resulterar i I F = A K T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Eller mellan z = Δ - t / 2 och z = Δ + t / 2, dvs inom ett tunt skikt av tjocklek t, t.ex. ett cellmembran belägen på ett avstånd Δ från gränsytan. I detta fall, kan fluorescensintensiteten beräknas som I F = A K T (Θ) TE-Δ / d (Θ) Om t är liten i jämförelse med Δ. ENT &quot;&gt; Från ekvationerna (4) och (5) cell-substrat avstånd Δ kan beräknas, om bilder av fluorescensintensitet I F registreras för variabla vinklar Θ och om ln (I F / T d) (Ekv. 4) eller ln (I F / T) (Ekv. 5) utvärderas som en funktion av 1 / d för dessa vinklar. För membran markören laurdan används i detta dokument (s. nedan) Utvärderingen utfördes enligt Ekv. 5. Som tidigare rapporterats 3, bild förvärv och utvärdering kräver - Homogen fördelning av excitationsljus över provet, - Giltigheten av en 2-lagers modell (med brytningsindex n 1 och n 2 för substratet och cytoplasman, respektive). Detta gäller, om plasmamembranet är mycket tunn, och om skiktet av det extracellulära mediet (mellan cellen och substratet) är liten jämfört med våglängden hos infallande ljus. Dessutom, en måttlig numerisk apertur(Typiskt A ≤ 0,90) i mikroskopet objektiv är fördelaktigt att undvika avvikelser i ljusstyrka beroende på anisotropi av strålning i närområdet av den dielektriska gränssnittet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Företag </td><td> Typ </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminärt flöde </td><td> Holten Säker </td><td> S2010 1,2 SV GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% penicillin / streptomycin </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Odlingssubstrat </td></tr><tr><td> Glasföremål diabilder </td><td> Marienfeld </td><td> Ren vitt glas </td><td> Speciell rengöring förfarande som används </td></tr><tr><td> 6-dodekanoyl-2-dimetylamino-naftalen (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Fluorescerande markör (Stamlösning: 2 mM i etanol) </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Laserdiod </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 med chaufför PDL 800-B </td><td> Våglängd: 391 nm </td></tr><tr><td> Singelmodfiber systemet </td><td> Punktkälla </td><td> kineFlex </td><td> Används med kollimerande optik </td></tr><tr><td> EMCCD kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Tillbaka belyst kamera </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Yta topologi, t.ex. av celler som växer på ett substrat, bestäms med nanometer precision genom variabel-Vinkel total intern reflektion fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM). Celler odlas på transparenta objektglas och inkuberas med en fluorescerande markör homogent fördelade i deras plasmamembran. Belysning sker genom en parallell laserstråle under varierande vinklar av total intern reflektion (TIR) ​​med olika inträngningsdjup av det evanescenta elektromagnetiska fältet. Registrering av fluorescensbilder vid bestrålning vid ca 10 olika vinklar medger att beräkna cell-substrat avstånd med en precision av några nanometer. Skillnader i vidhäftning mellan olika cellinjer, t.ex. cancerceller och mindre maligna celler, är sålunda bestämda. Dessutom, kan eventuella förändringar av celladhesion vid kemisk eller fotodynamisk behandling undersökas. I jämförelse med andra metoder för super-upplösning mikroskopi ljusexponering hållsmycket liten, och ingen skada av levande celler förväntas ske.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologi av celladhesion på ett substrat mäts med nanometer precision genom variabel vinkel total inre reflektion fluorescens mikroskopi (VA-TIRFM).

Nanotopology av celladhesion vid rörlig Vinkel total inre reflektion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Bead aggregeringsanalyser för karakterisering av Förmodade celladhesionsmolekyler

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-släckning av en Liposomal-inkapslad Nära-infraröd fluoroforen som ett verktyg för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk avbildning

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoaktiverat Lokalisering Mikroskopi med Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enda molekyl fluorescensmikroskopi på Planar bilayers stöds

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...