Name: mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في جزء منح R01 DK060581، R01 DK083583 (على حد سواء لRGM).

مطلوب مواد A.: انظر الجدول 1 (الكواشف) قبل إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (P / S): 100 مل 10X HBSS + 900 مل + H 2 0 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (المخزنة في الثلاجة أو أبقى على الجليد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و20٪ BSA الأسهم في المياه وaliquoted وتخزينها في -20 درجة C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (BSA): 1X 200 مل HBSS (P / S) + 3 مل من 20٪ BSA (BSA تركيزات النهائي هو 0.3٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جزيرة المتوسطة: RPMI + 10٪ FBS + الجلوتامين 1٪ + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Histopaque 1100: 240 [مل 1119 مل + 200 Histopaque 1077 Histopaque </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة 4-0 (مكيسون): مقطعة إلى قطع ¾ 2 بوصة وتخزينها في طبق بتري 10 سم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصكوك: ثني ملقط من أدوات العلوم الجميلة إلى 90 درجة، ورفع أسفل الأسنان مسننة من كل ثلاثة أزواج من ملقط. والهدف من ذلك هو أسنان مملة، وليس لإزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قنية لإدارة كولاجيناز / البروتيني خليط: 27G ½ بوصة إبرة، 30 ½ بوصةإبرة، أنابيب PE50 مقطعة إلى قطع 12 بوصة. ملف كل من الإبر لتصل إلى نهاية سلسة تقريب ليس لها حواف حادة. إدراج إبرة 27G في واحدة من نهاية 12 بوصة قطعة من PE50 الأنابيب. إزالة الإبرة 30G من الغلاف عن طريق تحطيم الغلاف مع زوج من كماشة، وتحول الغلاف ¼ تشغيل في كل مرة. إزالة الإبرة مع كماشة من الغلاف وأدخله في الطرف الآخر من الأنبوب PE50 تحت المجهر تشريح. تأكد من عدم شبك الأنبوب عند إدراج الإبرة في أنابيب PE50. الإبرة 27G هو نهاية التي سوف نعلق المحقنة من كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاجيناز (CI إنزيم MA) والبروتياز متعادلة (CI إنزيم BP). إعادة تشكيل TDE فقا لتعليمات الشركة الصانعة. الرجوع إلى شهادة الكثير من تحليل محدد لحساب تركيز نشاط انزيم. نقل ما مجموعه 350،000 وحدة الكولاجين المهينة (CDA) نشاط كولاجيناز المعاد و100،000 وحدة البروتيني المحايد للreconstituted BP البروتياز في أنبوب مخروطي الشكل وتمييع إجمالي يصل إلى 15 مل في HBSS (P / S) </li></ol> B. الخطوة بخطوة البروتوكول 1. التضخم البنكرياس مع كولاجيناز / البروتياز خليط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم، تشبع الجذع الفأر مع EtOH 70٪، تجويف البطن مفتوحة تماما من فتحة الشرج إلى الحجاب الحاجز مع أي مقص وملقط تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على منصة المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الأعور والقولون الصاعد من وتضعها خارج تجويف الجسم إلى يسارك. انظر الشكل 1 للاطلاع على موجز للخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فصوص من الكبد ضد الحجاب الحاجز، بل ينبغي أن يظل هناك إذا تجويف الجسم مفتوح بعيدا بما فيه الكفاية. العثور على الشريان الكبدي، والوريد البابي الصفراء حزمة القناة المؤدية إلى الكبد عن طريق تجتاح العفج مع ملقط المنحني. مع آخر زوج من ملقط المنحني، إليها تحت الوريد، الشريان، وبو لاصقndle وسحب 2 ¾ فيها قطعة من خياطة 4-0 تحت القناة الشريان الوريد، والصفراء، وادراك التعادل مرة واحدة وتسحبه ضيقة أقرب إلى الكبد ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين من أزواج من ملقط المنحني، والاستيلاء بعناية العفج والعثور على القناة الصفراوية التي تعلق على الاثني عشر في الحليمة. استخدام ملقط تونغ من لكزة من خلال البنكرياس والأنسجة الضامة الحق بموجب وثيقة القناة الصفراوية إلى حليمة. كزة ملقط بسرعة من خلال الجهاز لجعل حفرة ثم نضع كلا من ملقط ملقط من خلال والاستيلاء على آخر قطعة 2 ¾ بوصة من الخيط 4-0 والتعادل عن طريق لمرة واحدة وتسحبه إلى دائرة صغيرة، ولكن لا تسحب مشددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير إلى ملقط ° 90 و فائق الجودة إلى Vannas المقص. مع ملقط ° 90، قرصة بعناية وسحب الأمعاء الدقيقة حتى القناة الصفراوية هو مشدود. جعل واحدة خفض الأفقي عبر الحليمة مع مقص المقص من طعن مفتوحة إلى الأمعاء ثم قطع مع اقتراح واحد. في محاولة لجعل فقط سقطع شمال شرق عبر الحليمة دون طرد القناة الصفراوية من حليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الاستمرار في الضغط على الأمعاء مع ملقط 90 درجة، تضاف قنية في القناة الصفراوية حتى طول النصف من القناة الصفراوية، ومن ثم سحب الخيط بلطف مشددة حول قنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 3 مل مل مع 2.0 من كولاجيناز / البروتيني وحقن خليط في قنية بوتيرة بطيئة، مستمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التضخم في البنكرياس اكتمال إزالة قنية من القناة الصفراوية واستخدام ملقط ومقص منحني منحني الربيع لإزالة تضخم في البنكرياس من خلال البدء في القولون النازل والقص النسيج الضام كما كنت سحب ما يصل الأمعاء. تواصل إزالة البنكرياس من الأمعاء حتى تصل إلى القناة الصفراوية، ثم إزالة البنكرياس من الطحال، ثم المعدة والأحشاء ثم من من تجويف البطن. إنهاء إزالة من القص بعيدا الغرز. إضافة إلى أنبوب البنكرياس 50 مل تحتوي على 5 مل من HBSS(P / S). يجب أن يكون هذا الأنبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء أعلاه لكل حيوان ما يصل إلى أربعة حيوانات. لأفضل النتائج، فصل أربعة فقط بنكرياسات في وقت واحد. عادة، في حين أن الأربعة الأولى هي في حمام مائي 37 ° C، ونحن تضخيم آخر بنكرياسات الأربعة. </li></ol> 2. البنكرياس التفكك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب تحتوي على 50 مل بنكرياسات إلى 37 درجة C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صخرة بلطف أنبوب التفكك والتحقق من الأنسجة، والأنسجة مما لا شك يأتي بعيدا بسهولة، ثم دوامة الأنابيب 12 مرة بينما كنت عقد الأنبوب من الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة لا أكثر من 30 مل من HBSS (BSA) (يمكن أن يكون هذا مبلغ أقل، تبعا لمدى هو مطلوب لتحقيق التوازن في أنابيب الطرد المركزي للخطوة)، وأجهزة الطرد المركزي الى 290 XG لمدة دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف بعناية وترك كمية صغيرة من طاف (2-3 مل) في أسفل حتى لا تعطل بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 30 مل اتاك[هد] ل14G إبرة، إضافة لا أكثر من 10 مل من HBSS (BSA) ونضح تعليق صعودا وهبوطا 2 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الخليط من خلال مصفاة الخلية الشاي البلاستيك في أنبوب 50 مل وشطف مع آخر HBSS مل 10 (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 330 x ج لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الطافي وعكس أنابيب لتصريف على منشفة ورقية ماصة لل1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق كل أنبوب 10 مل في 1100 histopaque الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب histopaque مع HBSS مل 10 (BSA) وأجهزة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 18 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كامل 20 مل من طاف باستخدام الماصة كبيرة تحمل مل 25 و تمرير طاف من خلال ميكرومتر 70 مقلوب التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجزر في طبق بتري الطول 10 بواسطة pipetting 10 مل من خلال وسائل الإعلام جزيرة تصفية حين عقد الجانب الأيمن على مدى الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الجزر في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة الثقافة حتى الأنسجة جاهزة للتجريب. عادة، يتم الجزر اختارهم وعدها قبل experimentation. </li></ol> 3. ممثل النتائج غلة جزيرة، مورفولوجيا، والجودة هي المعايير العامة المستخدمة في الحكم على نجاح العزلة جزيرة. في أيدينا، والمحاصيل جزيرة من C57BL المتوسط ​​/ 6 هي الماوس في نطاق 150-250 الجزر باستخدام هذا البروتوكول (انظر الجدول 2)، وقابلة للمقارنة مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الأمثل سيغما نوع XI كولاجيناز. ومع ذلك، يمكن عوائد تختلف تبعا للسلالة الماوس المستخدمة وعمر من الفأرة. معظم الحيوانات التي نتبعها هي في الفئة العمرية 8-16 أسبوع وقد تم اختبار هذا البروتوكول على سلالات الفئران متعددة، بما في ذلك C57BL / 6 (180-250 الجزر / الماوس)، CD1 (200-300 الجزر / الماوس)، 129 / B6 (200-300 الجزر / الماوس)، BLKS-db/db (120-200 الجزر / الماوس)، NOD (10 أسابيع، 100-150 الجزر / الماوس)، وNOD-SCID (100-150 الجزر / الماوس ). ويظهر عادة التشكل جزيرة في الشكل 2 الذي يملك الجزر مستديرة لمستطيل الشكل مع حجم موحد نسبيا (على الرغم من حجم UNIFيمكن تختلف من سلالة ormity لسلالة). ويبين الشكل 3 تحليلنا نموذجية من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين من C57BL / 6 الجزر المعزولة باستخدام الماوس TDEs تنقية مقابل سيغما كولاجيناز XI نوع. عادة، وهي جزيرة نتائج جيدة في إعداد عالية التحفيز الأنسولين الجلوكوز في 25 ملم وهذا هو 6-20 أضعاف تلك التي لوحظت في الجلوكوز 2.5 ملم. ويمكن أيضا أن تستخدم تطبيقات أخرى لاختبار نوعية الجزر المعزولة، وهذه تشمل استخدام تقنيات perifusion، كاليفورنيا 2 + التصوير (مع Fura2)، وعكس النسخ-PCR، من بين 11 آخرين. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. موجز لكيفية تركيب الكانيولا من القناة الصفراوية. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تم الحصول عليها من الجزر المظهر النموذجي C57BL / 6 في عزلة على مدار 24 ساعة التالية. صور على فيverted المجهر على التكبير 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين من C57BL / الجزر 6. في عزلة على مدار 24 ساعة التالية، وحضنت 100 الجزر في طبق بشكل جيد ل12-1 ساعة عند 37 ° C-رينغر كريبس في HEPES مخزنة محلول يحتوي على 2.5 ملي الجلوكوز. ثم تم نقل إلى الجزر كريبس، قارع الأجراس في HEPES الجلوكوز 2.5 ملم لساعة إضافية، وبعد ذلك تم جمع طاف لقياس الأنسولين باستخدام اثنين من موقع immunospecific انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) (كريستال علم). تم نقل بعد ذلك إلى الجزر نفسها لكريبس، قارع الأجراس الحل HEPES مخزنة الجلوكوز تحتوي على 25 ملم، وتم قياس إفراز الأنسولين في المتوسط ​​عن طريق ELISA بعد 1 ساعة من الحضانة.

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS، SAT، وليس لديهم ما RGM الكشف عنها. يعمل AGB البلاغ VitaCyte. كاتب RCM له مصلحة في ملكية VitaCyte.

في هذا البروتوكول، ووصف الإجراء نحن لدينا لكيفية تركيب الكانيولا، نضح كولاجيناز، والتفكك في البنكرياس الفئران، بهدف عزل جزر لانجرهانز. من الناحية الفنية، لدينا وسيلة، يتقن مرة واحدة، يجب أن تسمح لعزل البنكرياس في غضون 4 دقائق من euthanizing الحيوان، و1 ساعة ينبغي أن يؤدي إلى عزل الجزر من حيوان واحد. سرعة هذه التقنية تسمح لنا لعزل الجزر من الفئران تصل إلى 12 في امتداد نموذجية، مما يؤدي إلى عزلة تصل إلى 3،000 الجزر. على عكس غيرها من البروتوكولات التي تستخدم الاستعدادات الخام من كولاجيناز، بروتوكول لدينا ميزات استخدام البروتياز تنقيته، CI إنزيم MA collagenase وCI البروتياز BP إنزيم. الاختلافات في اتساق الاستعدادات TDE المتوفرة تجاريا يتطلب أن يتم اختبار كل على حدة الكثير والأمثل قبل استخدام العام. أدى هذا التغير إلى الكثير الكثير منا النظر في استخدام بوريfied TDEs من VitaCyte. وتتميز هذه TDEs عالي النقاء من أساليب متعددة بما في ذلك استخدام المقايسات الحساسة مضان الركيزة المسمى. الفحص CDA الاستشعاع أكثر حساسية لأشكال مختلفة من كولاجيناز الجزيئية التي لها حركية مختلفة في الكولاجين الأصلية المهينة. المقايسات التاريخية الركيزة الببتيد تقديم تقييم غير مكتملة من كولاجيناز. تميز كولاجيناز بواسطة أساليب متعددة تضمن أكبر نشاط انزيم بين الكثير. على أساس الاختبار في منزلنا باستخدام مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية كولاجيناز المتاحة تجاريا، وجدنا أن الانزيم المنقى تركيبات أسفرت استنساخه الكثير إلى الكثير نتائج. ومرة واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام TDEs عالي النقاء ويتميز بدقة في هذا الطلب تكوين انزيم يعرف الأمثل، وأكد على اتساق أداء الكثير إلى الكثير. هذا الاتساق يلغي عملية كثيفة العمالة التأهيل المطلوبة عادة الكثيركولاجيناز للمنتجات الخام أو المخصب. TDEs المنقى أيضا تمكين تعديلات إضافية للتكوين من أجل تحسين الإنتاجية ونوعية الجزر تعافى من سلالات الفئران مختلفة. يمكن الإبلاغ التراكيب انزيم الأمثل لعزل الجزر من سلالات مختلفة من الفئران يكون أكثر فعالية إبلاغها. وهذا، بدوره، يؤدي إلى استخدام أكثر إنتاجية للموارد وتحسين المرونة في التصميم التجريبي. هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر على نتائج جزيرة العزلة باستخدام بروتوكول دينا. الأول هو الحاجة إلى تحقيق التضخم فعالة في البنكرياس خلال نضح من تحضير الانزيم. من المهم أن تبدأ التضخم بقوة لطيف على الحقنة، وزيادة القوة وعن انتفاخ البنكرياس. ومن المفيد لتحريك الأمعاء والبنكرياس خلال رفع التضخم بحيث كولاجيناز perfuses الجهاز بأكمله. خطوة حاسمة أخرى هي القوة مع أي واحد يهز بعد عملية الشراء أنابيبص الحضانة عند 37 درجة مئوية (الخطوة 2.2). لقد وجدنا أن تهز البنكرياس الثابت ضد غطاء للأنبوب يسبب تفتت الجزر، ولكن من دون أي شكل من أشكال التفكك الميكانيكية في هذه الخطوة، والمحاصيل يمكن أن تقع جزيرة بشكل كبير. ومن الضروري أيضا أن الخطوة خلال التفكك مع حقنة (الخطوة 2.5)، يتم تطبيق قوة متوسطة المستوى خلال الحركة صعودا وهبوطا مع المكبس، وهذا يضمن كافية التفكك الأنسجة قبل الخطوة تصفية (2.6)، حيث القليل جدا ينبغي الإبقاء على الأنسجة الشاي تصفية مصفاة. وأخيرا، فإن الخطوة الأخيرة لمتابعة بعناية هو ما تصبو إليه 20 مل كامل من الجزر ومجزأة histopaque. على الرغم من أن الجزر وعادة ما تكون في واجهة من وhistopaque HBSS، وجدنا أن نفقد الجزر عندما نحاول إزالة واجهة فقط، بدلا من ذلك، ونحن الآن إزالة كامل 20 مل باستخدام الماصة كبيرة تحمل 25 مل. واضاف نحن في الترشيح من خلال فلتر مقلوب ميكرون 70 (الخطوة 2.11) للقضاء على الحاجة إلى Centrifuge الجزر مرارا وتكرارا ليغسل histopaque.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td></td><td> كتالوج # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> فيشر العلمية </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> سيغما الدريتش </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 لفة خياطة يارد 100 </td><td> مكيسون </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 نهاية حادة ز إبرة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Sciss Vannas فائق الجودة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> مقص منحني الربيع </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> منحني الملقط (2) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> ملقط المنحني (لمدة 90 °) </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 بوصة إبرة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> إبرة 30G 1/2 بوصة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE أنابيب </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز MA </td><td> Vitacyte، LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP البروتياز </td><td> Vitacyte، LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> حقنة 3 مل </td><td> فيشر العلمية </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 مل حقنة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 ميكرون فلتر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 سم 2 طبق بتري </td><td> فيشر العلمية </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> مصفاة الشاي البلاستيكية </td><td> أي مطبخ العرض </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف والمعدات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> سيغما نوع XI (l010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110329) </td><td> MA (081104) BP (100823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. غلة جزيرة المتوسط ​​(± SD) باستخدام الكثير TDE مختلفة * * البيانات تمثل عائدات جزيرة متوسط ​​لا يقل عن 10 من الفئران. أرقام بين قوسين </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

تحول الاستجواب من خلية بيتا التعبير الجيني وظيفة مباشرة في المختبر على مر السنين من دراسة خطوط القوارض الخلية مكون للأورام لدراسة الجزر المعزولة القوارض. الجزر الرئيسية تقدم ميزة واضحة أنهم أكثر بأمانة تعكس مسارات إشارات بيولوجية الخلايا الإفرازية والردود. في حين تم طريقة العزل باستخدام الأنسجة جزيرة الانفصال انزيم (TDE) الاستعدادات راسخة في العديد من المختبرات 1-4، الاختلافات في اتساق وجودة محصول جزيرة من أي سلالة القوارض نظرا تحد من مدى جدوى ودراسات جزيرة الأولية. هذه الاختلافات غالبا ما تحدث نتيجة لتنقية الخام TDEs جزئيا المستخدمة في إجراء العزل جزيرة؛ TDEs يحمل في كثير من الأحيان إلى الكثير الكثير الاختلافات في النشاط وغالبا ما تتطلب إدخال تعديلات على جرعة من الانزيم المستخدمة. وقد استخدم عدد قليل من التقارير عن العزلة TDEs تنقية الخلايا القوارض 5 و 6 </suف&gt;، ولكن هذه الممارسة تتعرض لنطاق واسع على الرغم من الاستخدام الروتيني ومزايا تنقية TDEs للجزيرة العزلة الإنسان. بالتعاون مع VitaCyte، ​​LLC (إنديانابوليس، IN)، وضعنا الماوس جزيرة تعديل بروتوكول العزلة على أساس تلك التي وصفها Gotoh 7 و 8، والتي هي في perfused TDEs مباشرة في قناة البنكرياس من الفئران، تليها تجزئة النسيج الخام عبر التدرج Histopaque 9، وعزل تنقية الجزر. اختلاف كبير في بروتوكول لدينا هو استخدام كولاجيناز المطهرون (CI إنزيم MA) ومحايد الجمع البروتيني (CI إنزيم BP). تميزت كولاجيناز من استخدام الكولاجين مضان 6 المهينة مقايسة (CDA) النشاط التي تستخدم fluorescently المسمى الجلد العجل للذوبان الألياف والركيزة 6. هذه الركيزة هو أكثر التنبؤية لحركية تدهور الكولاجين في المصفوفة الأنسجة لأنها تعتمد على الكولاجين الأصليين الركيزة. كان الفصل البروتينيaracterized مع مقايسة الحساسة الحركية الفلورسنت 10. الاستفادة من هذه المقايسات تحسين جنبا إلى جنب مع التحليل الكيميائية الحيوية التقليدية تمكن من تصنيع TDE أكثر اتساقا، مما يؤدي إلى تحسين الأداء الاتساق بين الكثير. على النحو الأمثل وصفها في البروتوكول هنا للجزيرة الغلة القصوى والمثلى باستخدام التشكل جزيرة C57BL / الفئران 6. خلال تطوير هذا البروتوكول، وتم تقييم مجموعات عديدة من كولاجيناز والبروتياز محايدة في تركيزات مختلفة، ونسبة النهائية للكولاجيناز: البروتيني محايدة من يمثل أداء الإنزيم 35:10 مماثلة لنوع سيغما الحادي عشر. لأن تم الإبلاغ تقلب عوائد كبيرة في جزيرة المتوسط ​​من سلالات مختلفة من الجرذان والفئران، ينبغي إجراء تعديلات إضافية للتكوين TDE لتحسين المحصول ونوعية الجزر تعافى من مختلف الأنواع والسلالات.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.

الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

فأري عزل جزيرة البنكرياس

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الأول : الهضم ومجموعة من الأنسجة البنكرياس

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الثاني : تنقية الثقافة والإنسان من الفشوت

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...