Name: genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons
Uploaded: 2012-08-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies te FZ uit NIH (R01NS064288) en de Craig H. Neilsen Foundation.

1. Voorbereiding van Dekglaasjes, kweekmedium, en Spijsvertering Enzymen <ol><li> De 12 mm rond nr.1 dekglaasjes worden gebruikt voor het neuronale cultuur. De dekglaasjes worden gereinigd met 10% HCl gevolgd door overnacht ultrasone wassen met gedestilleerd en gedeïoniseerd water 3 keer (20 min / uur). De gereinigde dekglaasjes worden opgeslagen in 70% ethanol voor toekomstig gebruik. Voor elke experimenten, de dekglaasjes worden de lucht gedroogd en geplaatst in de cultuur plaat. </li><li> Om de gedroogde laag dekg...

<ol>
	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

Volwassen DRG neuronen hun axonen regenereren robuust na perifere zenuwschade in vivo en in vitro, en zo een nuttig systeem om regeneratie van axonen studie bij volwassen dieren. In vitro cultuur van volwassen DRG neuronen wordt steeds een veel gebruikte methode om de moleculaire mechanismen te onderzoeken waardoor regeneratie van axonen wordt geregeld. De in vitro procedure van het kweken van volwassen muis DRG neuronen die hier in staat stelt snel en doeltreffend genetische studie v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine hydrobromide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluor-2-deoxyuridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Glazen dekglaasjes (# 1) </td><td> Elektronen Microscopie wetenschappen </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 goed celkweek plaat </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 tot 040-CV </td></tr><tr><td> Steriel, gedestilleerd en gedeïoniseerd water </td><td> Mediatech </td><td> 25 tot 055-CV </td></tr><tr><td> Nucleofector en elektroporatie Kits voor muis neuronen </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA tegen c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> Anti - βIII tubuline antilichaam (tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> ProLong Gold Antifade bevestigingsoplossing </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

Het is algemeen bekend dat volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen niet hun axonen regenereren na blessures als gevolg van verminderde intrinsieke vermogen om axon groei en een vijandige omgeving in de volwassen CZS 1,2 ondersteunen. In tegenstelling tot volwassen neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS) gemakkelijk te regenereren na blessures 3. Volwassen dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen zijn goed bekend bij krachtig regenereren na perifere zenuwletsels. Elke DRG neuronen groeit een axon van de cel soma, met vestigingen in twee axonale bedrijfstakken: een perifere tak innerveren perifere doelen en een centrale vestiging zich uitstrekt tot in het ruggenmerg. Letsel van de DRG perifere axonen resulteert in een aanzienlijke regeneratie van axonen, dat de door centrale axonen in het ruggenmerg slecht regenereren na het letsel. Echter, als de perifere axonale schade optreedt voorafgaand aan het ruggenmerg (een proces genaamd de conditionering laesie), regeneratie van het centrum van axonen is greatly verbeterd 4. Bovendien is de centrale axonen van DRG neuronen dezelfde vijandige omgeving als dalende corticospinale axonen in het ruggenmerg. Samen, wordt verondersteld dat de moleculaire mechanismen die regeneratie van axonen van de volwassen DRG neuronen kan worden aangewend om CNS regeneratie van axonen te verbeteren. Als gevolg daarvan zijn volwassen DRG neuronen nu op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om te studeren regeneratieve axon groei van 5-7. Hier beschrijven een werkwijze voor volwassenen DRG neuron cultuur kan worden gebruikt voor genetische studie van axon regeneratie in vitro. In dit model volwassen DRG neuronen zijn genetisch gemanipuleerd via elektroporatie-gemedieerde gen transfectie 6,8. Door transfecteren neuronen met DNA-plasmide of Si / shRNA, deze aanpak maakt zowel winst-en verlies-van-functie experimenten om te onderzoeken de rol van elk gen-of-interest in axon groei van volwassen DRG neuronen. Wanneer neuronen worden getransfecteerd met si / shRNA, de beoogde endogene eiwit ismeestal leeg is na het 3-4 dagen in cultuur, gedurende welke tijd robuuste axongroei al heeft plaatsgevonden, waardoor de verlies-van-functie studies minder effectief. Als oplossing voor dit probleem beschreven methode omvat een resuspensie en opnieuw uitplaten stap na transfectie, waardoor axons opnieuw groeien neuronen in afwezigheid van de gerichte eiwit. Tot slot geven we een voorbeeld van het gebruik van deze in vitro model om de rol van een axon regeneratie-geassocieerde gen, c-Jun, studeren in het bemiddelen axon groei van volwassen DRG neuronen 9.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model voor genetische studie van regeneratie van axonen met gekweekte volwassen muis dorsale wortel ganglion neuronen wordt beschreven. De methode omvat een re-suspension/re-plating stap naar axon opnieuw groei mogelijk te maken van neuronen ondergaat genetische manipulatie. Deze aanpak is vooral handig voor verlies-van-functie studies van regeneratie van axonen met behulp van RNAi-gebaseerde proteïne knockdown.

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modellering van kanker zoals Neurale Invasion: De dorsale wortel ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy voor lumbale achterwortelganglia Ganglion toegang en injectie in varkens

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Snelle isolatie van dorsale wortel ganglion macrofagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...