Name: genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons
Uploaded: 2012-08-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של FZ-NIH (R01NS064288) ואת ה &#39;קרייג Neilsen קרן.

1. הכנת Coverslips בינוני, תרבות, עיכול ואנזימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב של 12 מ&quot;מ # 1 coverslips זכוכית משמשים תרבות העצבית. Coverslips את מנקים עם 10% HCL לילה ואחריו רחצה קולי עם מים מזוקקים deionized במשך 3 פעמים (20 דקות / שעה). Coverslips את ניקה מאוחסנים אתנול 70% ?...

<ol>
	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

למבוגרים נוירונים DRG להתחדש האקסונים שלהם וחסונה לאחר פגיעה עצבית היקפית in vivo ו - in vitro, ובכך לספק מערכת שימושית ללמוד התחדשות האקסון אצל בעלי חיים בוגרים. בתרבות חוץ גופית של נוירונים בוגרים DRG נעשה שימוש נרחב בשיטה לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין hydrobromide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2-deoxyuridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> רוש </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE אקספרס </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין (100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips (# 1) </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים מדעי </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 תא היטב בתרבות צלחת </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> סטרילי, מים מזוקקים deionized </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Nucleofector ו electroporation ערכות עבור נוירונים עכבר </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ב-siRNA TARGETplus נגד C-יוני </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> אנטי - נוגדן טובולין βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> להאריך Antifade זהב הפתרון גובר </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></TBODY&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

זה ידוע היטב כי נוירונים בוגרים במערכת העצבים המרכזית (CNS) לא יכול להתחדש האקסונים שלהם לאחר פציעות עקב היכולת הפנימית פחתה כדי לתמוך בצמיחה האקסון וסביבה עוינת 1,2 CNS בוגרת. לעומת זאת, נוירונים בוגרים במערכת העצבים ההיקפית (PNS) להתחדש בקלות אחרי 3 פציעות. למבוגרים הגב הגנגליון שורש (DRG) נוירונים ידועים להתחדש וחסונה לאחר פציעות עצבים היקפיים. כל תא עצב DRG גדל האקסון 1 מ סומה התא, אילו ענפים לשני סניפים: הסניף axonal היקפי innervating מטרות הפריפריה והסניף המרכזי הרחבת לתוך חוט השדרה. הפציעה של אקסונים היקפיים תוצאות DRG התחדשות האקסון משמעותי, ואילו אקסונים מרכזיות בחוט השדרה להתחדש גרוע לאחר פציעה. עם זאת, אם הפגיעה axonal היקפי מתרחשת לפני הפגיעה בחוט השדרה (תהליך הנקרא הנגע מיזוג), התחדשות של אקסונים המרכזיים הוא greatlY משופרת 4. יתר על כן, אקסונים המרכזיים של נוירונים DRG לשתף את הסביבה העוינת כמו יורד אקסונים corticospinal בחוט השדרה. יחד, ההשערה היא כי המנגנונים המולקולריים השולטים התחדשות האקסון של נוירונים בוגרים DRG ניתן לרתום כדי לשפר את מערכת העצבים המרכזית התחדשות האקסון. כתוצאה מכך, מבוגרים נוירונים DRG כיום שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד הצמיחה האקסון משובי 5-7. כאן אנו מתארים את השיטה של תרבות המבוגרים נוירון DRG, שניתן להשתמש בהם למחקר הגנטי של התחדשות האקסון במבחנה. ב הבוגרת מודל זה נוירונים DRG הם מניפולציה גנטית דרך transfection-electroporation בתיווך גן 6,8. על ידי transfecting נוירונים עם ה-DNA פלסמיד או סי / shRNA, גישה זו מאפשרת הן של רווח והפסד של תפקודי ניסויים כדי לבדוק את תפקידו של כל עניין הגנים של בצמיחה האקסון מתא עצב DRG בוגרים. כאשר נוירונים הם transfected עם סי / shRNA, חלבון אנדוגני הוא ממוקדמרוקנת בדרך כלל לאחר 3-4 ימים בתרבות, במהלכם צמיחה איתנה זמן האקסון כבר התרחש, מה שהופך את ההפסד של תפקודי מחקרים פחות יעיל. כדי לפתור בעיה זו, השיטה המתוארת כאן כוללת צעד מחדש ההשעיה מחדש ציפוי לאחר transfection, המאפשר אקסונים מחדש לגדול מ נוירונים בהעדר חלבון מטרה. לבסוף, אנו מספקים דוגמה של שימוש במודל חוץ גופית כדי ללמוד את התפקיד של גנים הקשורים התחדשות האקסון, C-יוני, בתיווך הצמיחה של האקסון למבוגרים DRG נוירונים 9.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל המחקר הגנטי של התחדשות האקסון שימוש בתרבית עכבר בוגרים הגב שורש עצב הגנגליון מתואר. השיטה כוללת צעד re-suspension/re-plating לאפשר האקסון מחדש הצמיחה מתא עצב שעברו מניפולציה גנטית. גישה זו שימושית במיוחד עבור אובדן של תפקודי מחקרים של התחדשות האקסון באמצעות RNAi מבוסס מציאה חלבון.

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy גישה גנגליון המותני שורש העזוב, הזרקה של החזירים

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...