Name: genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons
Uploaded: 2012-08-17T12:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di FZ dal NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.

1. Preparazione di vetrini coprioggetti, terreno di coltura, e enzimi digestivi <ol><li> Il 12-mm tondo # 1 vetrini vengono utilizzati per la coltura neuronale. Le coprioggetti vengono puliti con il 10% HCL notte seguito da lavaggio ad ultrasuoni con acqua distillata deionizzata e per 3 volte (20 minuti / tempo). Le coprioggetti puliti sono memorizzati in etanolo 70% per un uso futuro. Prima di ogni sperimentazione, i coprioggetti sono dotate di aria essiccata e inseriti nella piastra di coltura. </li><li> Per rivesti...

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	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

Adulti neuroni DRG rigenerare i loro assoni robusta dopo lesioni dei nervi periferici in vivo e in vitro, fornendo così un sistema utile per studiare la rigenerazione degli assoni negli animali adulti. Coltura in vitro di neuroni DRG adulti sta diventando un metodo ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari attraverso i quali la rigenerazione degli assoni è regolamentata. La procedura in vitro di neuroni adulti, la coltura del mouse DRG qui presentato consente una ra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poly-D-lisina bromidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2-desossiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> Triplo espresso </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto (# 1) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 e piastra di coltura cellulare </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Sterile, acqua distillata e deionizzata </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Kit Nucleofector ed elettroporazione per i neuroni del mouse </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA contro c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043.776 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti - tubulina βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Prolungare Antifade soluzione oro di montaggio </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

È noto che i neuroni maturi nel sistema nervoso centrale (CNS) non può rigenerare loro assoni dopo lesioni per diminuita capacità intrinseca di supportare la crescita assonale e un ambiente ostile in 1,2 maturo CNS. Al contrario, i neuroni maturi nel sistema nervoso periferico (PNS) rigenerare facilmente dopo lesioni 3. Adulti dei gangli della radice dorsale (DRG) i neuroni sono ben noti per rigenerare robusto dopo lesioni dei nervi periferici. Ogni neurone DRG cresce uno assone dal soma cellulare, che si dirama in due rami assonali: un ramo periferico innerva bersagli periferici e un ramo centrale che si estende nel midollo spinale. Lesioni dei DRG risultati assoni periferici nella rigenerazione degli assoni sostanziale, mentre gli assoni centrali nel midollo spinale rigenerare poco dopo la lesione. Tuttavia, se la lesione assonale periferico si verifica prima della lesione del midollo spinale (un processo chiamato la lesione condizionamento), rigenerazione di assoni centrali è greatly migliorata 4. Inoltre, gli assoni dei neuroni centrali DRG condividono lo stesso ambiente ostile come discendente assoni corticospinali nel midollo spinale. Insieme, si ipotizza che i meccanismi molecolari che controllano la rigenerazione degli assoni dei neuroni DRG adulti può essere sfruttata per migliorare la rigenerazione degli assoni del SNC. Come risultato, i neuroni DRG adulti vengono ora ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la crescita assonale rigenerativa 5-7. Qui si descrive un metodo di coltura adulto DRG neurone che possono essere utilizzati per lo studio della rigenerazione assonale genetica in vitro. In questo modello i neuroni DRG adulti sono geneticamente manipolati tramite elettroporazione trasfezione mediata gene 6,8. Trasfettando neuroni con DNA plasmidico o SI / shRNA, questo approccio permette sia di guadagni e perdite di funzione esperimenti per studiare il ruolo di ogni gene d&#39;interesse in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti. Quando i neuroni sono trasfettate con SI / shRNA, la proteina endogena è miratadi solito dopo 3-4 giorni impoverito nella cultura, durante i quali il tempo robusta crescita degli assoni è già verificato, rendendo la perdita di funzione studi meno efficace. Per risolvere questo problema, il metodo qui descritto comprende una risospensione e ri-placcatura passo dopo trasfezione, che permette di assoni ricrescere dai neuroni in assenza della proteina mirata. Infine, forniamo un esempio di utilizzo di questo modello in vitro per studiare il ruolo di un gene associato rigenerazione degli assoni, c-Jun, a mediare la crescita degli assoni dei neuroni DRG da adulto 9.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per lo studio genetico della rigenerazione assonale adulte di topo in coltura con neuroni dei gangli della radice dorsale è descritto. Il metodo comprende una fase re-suspension/re-plating per consentire assoni ricrescita di neuroni sottoposti manipolazione genetica. Questo approccio è particolarmente utile per la perdita di funzione studi di rigenerazione degli assoni usando RNAi-based knockdown proteine.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

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Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Ricerca

Neuroscienze

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