Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door een Wellcome Trust Senior Fellowship toegekend aan Ian Goodfellow, en een Marie Curie Intra European Fellowship (KP7 European Research Council) uitgereikt aan Armando Arias. We willen graag Io Hong Cheong, dr. Rebecca Robey en Dr Mike Skinner bedanken voor het geven van ons toestemming om hun Agilent bioanalyser te gebruiken en te helpen met het runnen van RNA-monsters.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li><li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses.">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li><li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus.">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection.">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li><li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4.">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).</li><li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5'+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs.">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs:+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site.">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li><li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components.">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Hier hebben we geïllustreerd twee verschillende omgekeerde genetische benaderingen die het herstel van de besmettelijke MNV in celcultuur mogelijk te maken. Beide benaderingen effectief omzeilen absolute vereiste voor de covalente koppeling van VPG aan het 5&#39;-uiteinde van het virale genoom RNA via de vorming van capped MNV transcripten die vervolgens worden herkend door het cellulaire ribosomen. In vitro transcriptie gevolgd door enzymatisch bovengrens is efficiënter het herstel van infectieuze MNV dan transcriptie van infectieuze plasmiden in cellen die T7 RNA-polymerase, waarbij de transcripten kan worden begrensd door het FPV aftopping enzymen. Virus titers teruggewonnen deze reverse genetics systemen zijn gelijk aan die verkregen door transfectie van virale VPG gekoppelde RNA gezuiverd uit geïnfecteerde celkweken 17 (figuur 5). De transfectie van de afgetopte MNV RNA in permissieve Raw264.7 cellen maakt een virus titer slechts 1-log lager dan experimenten met de transfection van totaal RNA van geïnfecteerde cellen die virale VPG gekoppelde RNA (figuur 5). Dit feit stimuleert verder onderzoek vast te stellen of de toevoeging van een VPG molecule aan het 5 &#39;uiteinde van transcripten die door deze systemen kunnen resulteren in verhoogde virusopbrengst die licht functionele aspecten onderliggende MNV infectiviteit in cellen geassocieerd VPG. Echter we dit reverse genetics systeem een zeer efficiënte een vergelijkbaar met andere RNA virussen reverse genetics die momenteel gebruikt in de in vitro getranscribeerde RNA het herstel van titers maar lager dan 10 tot 100 in reële infecties met virions 19, 20 toelaat. Over het geheel genomen de huidige methodieken vormen een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van norovirus moleculaire biologie en geven ons de tools om de functionele rol van eiwitten en RNA geconserveerde motieven in norovirus genomen te onderzoeken. Deze benaderingen zijn reeds gecombineerd met cUIDIGE muismodel beschikbaar zijn en hebben aangetoond dat MNV hersteld van infectieuze cDNA is in staat om dodelijke infectie van&gt; 80% STAT1-/ veroorzaken - muizen in minder dan 10 dagen 4, 21. Door gebruik van dit systeem wij hersteld levensvatbare muizen norovirus mutanten van de capside eiwitten en een polypyrimidine kanaal bij de binding van verschillende factoren gastheer (PTB en PCBP) een enigszins verzwakt fenotypen weergegeven in vivo 21, 22. Daarnaast hebben wij onlangs aangetoond dat virussen die het vermogen van de proteïne VF1 efficiënt drukken van ORF4 repliceren in celkweek maar ook zijn virulentie in muizen verminderd ten opzichte van WT MNV 8. Deze studies moedigen ons aan om verzwakte versies van humane norovirussen op basis van MNV studies die kunnen worden onderzocht als potentiële kandidaat-vaccins te ontwerpen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Lithiumchloride neerslag oplossing </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA-storage-oplossing </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 script </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Plafonnering System </td><td> Epicentre Biotechnologie </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon transfectiesysteem </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon transfectiesysteem kit </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 transfectiereagens </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustraties GFX PCR DNA en Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Menselijke norovirussen zijn verantwoordelijk voor de meeste gevallen van de menselijke gastro-enteritis (GE) de hele wereld en zijn steeds terugkerend probleem in een omgeving waar bijna van persoon tot persoon contact niet kan worden vermeden 1, 2. Gedurende de laatste jaren een toename in de incidentie van uitbraken in ziekenhuizen gemeld, waardoor hinderlijke storing in hun operationele capaciteit en de grote economische verliezen. De identificatie van nieuwe antivirale benaderingen is te wijten aan het onvermogen van de menselijke norovirussen naar een productieve infectie te voltooien in cel cultuur 3 beperkt. De recente isolatie van een murine norovirus (MNV), nauw verwant aan humane norovirus 4, maar die kunnen worden gekweekt in cellen 5 heeft nieuwe wegen voor het onderzoek van deze pathogenen 6, 7. MNV replicatie resulteert in de synthese van nieuwe positieve zin genoom en subgenomische RNA moleculen deze overeenkomt met de laatste third van het virale genoom (figuur 1). MNV bevat vier verschillende open leesramen (ORFs), waarvan ORF1 neemt de meeste van het genoom codeert en zeven niet-structurele eiwitten (NS1-7) vrij uit een polyproteïne precursor. ORF2 en ORF3 staan ​​in het subgenomische RNA regio coderen capside eiwitten (VP1 en VP2, respectievelijk) (figuur 1). Onlangs hebben we vastgesteld dat extra ORF4 overlappende ORF2 maar in een andere leesraam functioneel en codeert voor een mitochondriaal gelokaliseerde virulentiefactor (VF1) 8. Replicatie van positieve RNA virussen, zoals norovirussen, vindt plaats in het cytoplasma, waardoor de synthese van nieuwe afgetopte RNA-genomen. Om virale het vertalen te bevorderen, virussen te exploiteren verschillende strategieën die gericht zijn op het werven van de cellulaire eiwitsynthese machines 9-11. Interessant is norovirus vertaling gedreven door de multifunctionele virale eiwit-primer VPGcovalent gebonden aan het 5&#39;-uiteinde van zowel genomische en subgenomische RNA 12-14. Dit verfijnde mechanisme van de vertaling zal waarschijnlijk een belangrijke factor in de beperkte efficiëntie van virale herstel door middel van conventionele reverse genetics benaderingen zijn. Hier rapporteren twee verschillende strategieën gebaseerd op het genereren van muizen norovirus-1 (aangeduid als MNV hierbij) transcripten beperkt tot het 5 &#39;uiteinde. Een van de methoden betreft zowel in vitro synthese en de aftopping van de virale RNA, terwijl de tweede benadering houdt in de transcriptie van MNV cDNA in cellen die T7 RNA-polymerase. De beschikbaarheid van deze reverse genetics systeem voor de studie van MNV en een klein diermodel heeft een ongekende mogelijkheid om de rol van virale sequenties in replicatie en pathogenese 15-17 ontleden.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Norovirussen zijn een belangrijke oorzaak van gastro-enteritis nog moleculaire technieken voor de karakterisering zijn nog relatief nieuw. Hier rapporteren wij twee verschillende reverse genetics benaderingen voor de doeltreffende inning van murine norovirus (MNV), het enige lid van dit geslacht die kunnen worden gekweekt in celcultuur.

Reverse genetics Mediated Herstel van infectieuze Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plaque assay voor Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Voorbereiding van lymfkliertest submandibulaire speekselklier rechtop Intravital microscopie

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...