Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
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Cette recherche a été financée par une bourse du Wellcome Trust principal décerné à Ian Goodfellow, et une Marie Curie intra European Fellowship (7e PC European Research Council) a décerné à Armando Arias. Nous tenons à remercier Io Hong Cheong, le Dr Rebecca Robey et le Dr Mike Skinner de nous donner la permission d&#39;utiliser leur Bioanalyser Agilent et en aidant à l&#39;exécution des exemples d&#39;ARN.

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. 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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ici, nous avons illustré deux différentes approches génétiques inverse qui permettent la récupération de MNV infectieuses en culture cellulaire. Les deux approches de manière efficace de contourner l&#39;exigence absolue pour la liaison covalente de VPg à l&#39;extrémité 5 &#39;du génome ARN viral via la génération de transcrits MNV plafonnés, qui sont ensuite reconnus par les ribosomes cellulaires. La transcription in vitro suivie par voie enzymatique de coiffage est plus efficace dans la récupération des NVM infectieuse de la transcription de plasmides infectieuses dans des cellules exprimant l&#39;ARN polymérase T7, dans lequel les transcrits peut être coiffé par les enzymes FPV coiffage. Titres de virus récupérés avec ces systèmes de génétique inverse sont semblables à celles obtenues par transfection de VPg virales liées ARN purifiés à partir de cultures de cellules infectées 17 ans (figure 5). La transfection de l&#39;assiette MNV ARN dans les cellules permissives RAW264.7 rend un titre seul virus de 1 log inférieur expériences impliquant l&#39;transfection de l&#39;ARN total à partir de cellules infectées par le virus contenant des VPg liée ARN (Figure 5). Ce fait encourage de nouvelles investigations pour déterminer si l&#39;ajout d&#39;une molécule VPg à l&#39;extrémité 5 &#39;des transcrits générés par ces systèmes pourrait entraîner des rendements de virus a augmenté ce qui peut révéler des aspects fonctionnels qui sous-tendent l&#39;infectiosité MNV dans les cellules associées à VPg. Néanmoins, nous considérons que ce système de génétique inverse comme un très efficace comparable à d&#39;autres virus à ARN inverser systèmes de génétique actuellement utilisé dans laquelle le transcrit in vitro d&#39;ARN permet la récupération de titres seulement 10-100 inférieurs à ceux des infections réelles avec des virions 19, 20. Dans l&#39;ensemble, les méthodologies actuelles constituent une avancée significative dans le domaine de la biologie moléculaire et norovirus nous fournir les outils nécessaires pour enquêter sur les rôles fonctionnels des protéines et des motifs conservés dans les génomes ARN norovirus. Ces approches ont déjà été combiné avec cmodèle de souris ACTUEL disponibles et ont montré que MNV récupéré à partir d&#39;ADNc infectieux est en mesure de provoquer une infection mortelle de&gt; 80% STAT1-/ - souris en moins de 10 jours 4, 21. Faisant usage de ce système, nous avons récupéré viables mutants norovirus murin de la protéine de capside et d&#39;un tube polypyrimidine impliqué dans la liaison des facteurs de l&#39;hôte différents (PTB et PCBP) qui affichent un peu atténués phénotypes in vivo 21, 22. En outre, nous avons récemment démontré que les virus qui n&#39;ont pas la capacité d&#39;exprimer la protéine VF1 de ORF4 efficacement répliquer en culture cellulaire, mais encore une fois ont réduit la virulence chez la souris par rapport à WT MNV 8. Ces études nous incitent à concevoir des versions atténuées de norovirus humains fondées sur des études MNV qui pourraient être étudiés en tant que candidats vaccins potentiels.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Solution de précipitation au chlorure de lithium </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> Solution de stockage d&#39;ARN </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 de script </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap M7G Plafonnement du système </td><td> Biotechnologies Epicentre </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Système de transfection néon </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon kit système de transfection </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Réactif de transfection Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent ARN 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR de l&#39;ADN et Kit Gel purification Band </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX production à grande échelle du système ARN-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Norovirus humains sont responsables de la plupart des cas de gastro-entérite humaine (GE) dans le monde entier et sont des problèmes récurrents dans des environnements où près de personne à personne de contact ne peuvent pas être évitées 1, 2. Au cours des dernières années une augmentation de l&#39;incidence des épidémies dans les hôpitaux a été signalée, ce qui provoque d&#39;importantes perturbations de leur capacité opérationnelle ainsi que d&#39;importantes pertes économiques. L&#39;identification de nouvelles approches antivirales a été limitée en raison de l&#39;incapacité des norovirus humains pour compléter une infection productive dans 3 culture cellulaire. L&#39;isolement récent d&#39;un norovirus murin (MNV), étroitement liée à norovirus humain 4, mais qui peut se propager dans les cellules 5 a ouvert de nouvelles voies pour l&#39;enquête de ces agents pathogènes 6, 7. Les résultats de réplication MNV dans la synthèse de génomique nouveau sens positif et des molécules d&#39;ARN sous-génomique, celui-ci correspond à la dernière thie du génome viral (figure 1). MNV contient quatre différents cadres de lecture ouverts (ORF), dont ORF1 occupe la majeure partie du génome et code sept protéines non structurales (NS1-7) libérés à partir d&#39;un précurseur de polyprotéine. ORF2 et ORF3 sont contenus dans la région sub-génomique de l&#39;ARN et coder les protéines de capside (VP1 et VP2, respectivement) (figure 1). Récemment, nous avons déterminé que l&#39;ORF4 supplémentaires chevauchement ORF2, mais dans un cadre de lecture différent est fonctionnel et code pour un facteur de virulence localisée mitochondrial (VF1) 8. La réplication des virus à ARN positif pour le sens, y compris les norovirus, se déroule dans le cytoplasme aboutissant à la synthèse de nouveaux génomes ARN non plafonnés. Pour promouvoir la traduction virale, les virus profitent de différentes stratégies visant à recruter la machinerie de synthèse protéique cellulaire 9-11. Fait intéressant, la traduction norovirus est entraîné par le multifonctionnel protéine virale VPg-primaireliée de manière covalente à l&#39;extrémité 5 &#39;de deux ARN génomique et subgénomique 12-14. Ce mécanisme sophistiqué de la traduction est susceptible d&#39;être un facteur majeur dans l&#39;efficacité limitée de la reprise virale par les approches conventionnelles de génétique inverse. Nous rapportons ici deux stratégies différentes basées sur la génération de souris norovirus-1 (dénommé ci-joint MNV) transcriptions plafonnées à l&#39;extrémité 5 &#39;. Une des méthodes consiste à la fois la synthèse in vitro et le plafonnement de l&#39;ARN viral, tandis que la seconde approche implique la transcription de MNV ADNc dans des cellules exprimant la T7 RNA polymérase. La disponibilité de ces systèmes de génétique inverse pour l&#39;étude de MNV et un petit modèle animal a fourni une capacité sans précédent à disséquer le rôle de séquences virales dans la réplication et la pathogenèse 15-17.

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Les norovirus sont une cause majeure de gastro-entérite encore des techniques moléculaires pour leur caractérisation sont encore relativement nouvelle. Nous rapportons ici deux différentes approches de génétique inverse pour la récupération efficace des norovirus murin (MNV), le seul membre de ce genre qui peuvent être propagées en culture cellulaire.

Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

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