Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
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Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Fellowship ausgezeichnet zu Ian Goodfellow, und ein Marie Curie Intra European Fellowship (RP7 European Research Council) ausgezeichnet zu Armando Arias finanziert. Wir möchten Io Hong Cheong, Dr. Rebecca Robey und Dr. Mike Skinner, dass er uns die Erlaubnis, ihre Agilent Bioanalyzer bedienen und hilft mit fließendem RNA-Proben zu danken.

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Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir zwei verschiedene Reverse genetische Ansätze, die die Rückgewinnung von infektiösen MNV in Zellkultur ermöglichen dargestellt. Beide Ansätze wirksam zu umgehen die absolute Voraussetzung für die Verknüpfung kovalent VPg an das 5&#39;-Ende des viralen RNA-Genoms über die Erzeugung der begrenzten MNV Transkripte, die dann von den zellulären Ribosomen erkannt werden. In-vitro-Transkription durch enzymatisch Capping gefolgt ist effizienter die Rückgewinnung von infektiösen MNV als Transkription von infektiösen Plasmide in Zellen, die T7-RNA-Polymerase, bei dem die Transkripte von den FPV Capping Enzyme verschlossen werden kann. Virustiter mit diesen reversen Genetik zurückgewonnen entsprechen denen, die durch Transfektion von viralen VPg-verknüpfte RNA aus infizierten Zellkulturen 17 (5) gereinigt erhalten. Die Transfektion der begrenzten MNV-RNA in permissiven RAW 264.7-Zellen macht eine Virustiter nur 1-log niedriger als Experimente mit der transfection der Gesamt-RNA aus infizierten Zellen mit viralen VPG-linked-RNA (Abbildung 5). Diese Tatsache unterstützt weitere Untersuchungen zu bestimmen, ob die Zugabe eines VPg Molekül an das 5&#39;-Ende der Transkripte von diesen Systemen erzeugten zu einer erhöhten Virusausbeuten die funktionalen Aspekte zugrunde MNV Infektiosität in Zellen zugeordnet VPg untersucht werden kann, führen. Trotzdem betrachten wir dieses System als reversen Genetik umgekehrt eine hocheffiziente ein vergleichbar mit anderen RNA-Viren Genetik Systeme, die derzeit verwendet werden, in dem die In-vitro-transkribierte RNA die Erholung der Titer nur 10-100 niedriger als im wirklichen Infektionen mit Virionen 19, 20 ermöglicht. Insgesamt stellen die aktuellen Methoden einen erheblichen Fortschritt auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Norovirus liefern uns die Werkzeuge, um die funktionelle Rolle von Proteinen und RNA-Motive in konservierten Norovirus Genomen zu untersuchen. Diese Konzepte wurden bereits mit C kombinierttrom Mausmodell zur Verfügung und haben gezeigt, dass MNV von infektiösen cDNA erholt ist in der Lage, tödliche Infektion von&gt; 80% STAT1-/ verursachen - Mäuse in weniger als 10 Tagen 4, 21. Die Nutzung dieses Systems haben wir tragfähige murine Norovirus Mutanten des Kapsidprotein und einer Polypyrimidintrakt bei der Bindung von verschiedenen Host-Faktoren (PTB und PCBP), dass eine etwas abgeschwächte Phänotypen zeigen in vivo 21, 22 beteiligten sich erholt haben. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass Viren die Fähigkeit fehlt, die VF1 Protein aus ORF4 effizient ausdrücken in der Zellkultur zu replizieren, aber wieder haben Virulenz in Mäusen, die mit Bezug auf WT MNV 8 reduziert. Diese Studien ermutigen uns, abgeschwächte Versionen von menschlichen Noroviren auf MNV Studien, die als potenzielle Impfstoffe untersucht werden konnte entwerfen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Lithiumchlorid Fällungslösung </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA-Storage-Lösung </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7-Skript </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Capping-System </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon Transfektionssystem </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon Transfektionssystem Kit </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano-Kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA und Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Menschliche Noroviren sind verantwortlich für die meisten Fälle von menschlichen Gastroenteritis (GE) weltweit und sind immer wiederkehrendes Problem in Umgebungen, in denen nahe stehende Person zu Person Kontakt nicht 1, 2 vermieden werden können. In den letzten Jahren ein Anstieg der Häufigkeit der Ausbrüche in Krankenhäusern wurde berichtet, was zu erheblichen Störungen ihrer operativen Leistungsfähigkeit sowie große wirtschaftliche Verluste. Die Identifizierung von neuen antiviralen Ansätzen wurde aufgrund der Unfähigkeit des menschlichen Noroviren, um eine produktive Infektion in Zellkultur 3 vervollständigen begrenzt. Die kürzliche Isolierung eines murinen Norovirus (MNV), eng mit den menschlichen Norovirus 4, aber die Suchbegriffe in Zellen 5 werden ausgebreitet hat neue Wege zur Untersuchung dieser Pathogene 6, 7 geöffnet. MNV Replikation resultiert in der Synthese der neuen positiven Sinne genomischen und subgenomischen RNA-Moleküle, entspricht die letztere zur letzten third des viralen Genoms (Abbildung 1). MNV enthält vier verschiedene offene Leseraster (ORFs), von denen ORF1 nimmt den größten Teil des Genoms kodiert und sieben nicht-strukturelle Proteine ​​(NS1-7) aus einem Polyprotein-Vorläufer-Freigabe. ORF2 und ORF3 innerhalb des subgenomischen RNA-Region enthalten ist, und codieren die Capsid-Proteine ​​(VP1 und VP2, jeweils) (1). Vor kurzem haben wir diese zusätzliche ORF4 überlappenden ORF2 identifiziert, aber in einem anderen Leseraster ist funktional und kodiert für eine mitochondriale lokalisierte Virulenzfaktor (VF1) 8. Replikation für positive RNA Viren, einschließlich Noroviren, erfolgt im Zytoplasma, was zur Synthese neuer begrenzten RNA-Genome. Um virale Übersetzung zu fördern, zu nutzen Viren unterschiedliche Strategien bei der Einstellung des zellulären Proteinsynthese-Maschinerie 11.09 abzielen. Interessant ist, dass Norovirus-Übersetzung durch die multifunktionale virale Protein-Primer VPg angetriebenkovalent an das 5&#39;-Ende der beiden genomischen und subgenomischen RNAs 12-14 verbunden. Dieser ausgeklügelte Mechanismus der Übersetzung wird wahrscheinlich ein wichtiger Faktor in der geringen Effizienz der viralen Wiederherstellung durch konventionelle Methoden der reversen Genetik sein. Hier berichten wir zwei verschiedene Strategien, die auf die Generierung von murinen Norovirus-1 (im Folgenden als MNV beiliegenden) Transkripte am 5&#39;-Ende verschlossen. Eines der Verfahren umfasst sowohl in vitro Synthese und Begrenzung der viralen RNA, während die zweite Ansatz beinhaltet die Transkription der cDNA MNV in Zellen, die T7-RNA-Polymerase. Die Verfügbarkeit dieser reversen Genetik zum Studium von MNV und einem Tiermodell eine beispiellose Fähigkeit, die Rolle von viralen Sequenzen in Replikation und Pathogenese von 15 bis 17 zu zerlegen ist.

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Noroviren sind eine bedeutende Ursache von Gastroenteritis noch molekulare Techniken zu ihrer Charakterisierung sind noch relativ neu. Hier berichten wir über zwei verschiedene Ansätze der reversen Genetik für die effiziente Gewinnung von murinen Norovirus (MNV), das einzige Mitglied dieser Gattung, die in Zellkultur vermehrt werden kann.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...