Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לאיאן גודפלו, וגם מארי קירי תוך אחוות האירופי (FP7 המועצה האירופית למחקר) הוענק ארמנדו אריאס. אנו רוצים להודות איו הונג צ&#39;ונג, ד&quot;ר רבקה וד&quot;ר רובי מייק סקינר שנתן לנו רשות להשתמש bioanalyser Agilent שלהם ולעזור בניהול דגימות רנ&quot;א.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li><li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses.">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li><li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus.">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection.">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li><li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4.">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).</li><li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5'+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs.">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs:+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site.">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li><li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components.">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

כאן אנו הדגימו שתי גישות שונות גנטית הפוכה המאפשרים התאוששות MNV מדבקות תרבית תאים. שתי הגישות יעילות לעקוף את הדרישה מוחלטת הצמדה קוולנטית של VPg עד הסוף &#39;5 של הגנום RNA ויראלי באמצעות הדור של כתרים תמלילי MNV המוכרים מכן על ידי הריבוזומים הסלולר. ב שעתוק במבחנה ואחריו enzymatically מכסת יעיל יותר ההתאוששות של MNV זיהומיות מאשר שעתוק של פלסמידים זיהומיות בתאים המבטאים T7 רנ&quot;א פולימרז, שבו תעתיקי ניתן כתרים על ידי אנזימים FPV פיקוק. וירוס של הסרט התאושש עם מערכות אלה גנטיקה הפוכה דומים אלה שהושגו על ידי transfection של VPg צמודות רנ&quot;א נגיפי מטוהרים מן בתרביות תאים נגועים 17 (איור 5). Transfection של כתרים MNV RNA לתוך תאים Raw264.7 מתירנית הופך titre וירוס רק 1-log נמוך ניסויים הקשורים transfection של RNA הכולל תאים נגועים המכילים ויראלי VPg צמוד RNA (איור 5). עובדה זו מעודדת בדיקות נוספות כדי לקבוע אם תוספת של מולקולת VPg עד הסוף &#39;5 של תמלילי שנוצר על ידי מערכות אלה עלול לגרום עלייה בתשואות וירוס אשר עשוי לחשוף היבטים פונקציונליים שבבסיס infectivity MNV בתאים הקשורים VPg. עם זאת, אנו רואים במערכת זו גנטיקה הפוכה כמו 1 היעילה ביותר להשוות אחרים וירוסים RNA להפוך מערכות גנטיקה המשמש כיום שבו במבחנה RNA עיבד מאפשר התאוששות של הסרט רק 10-100 נמוך יותר מאשר זיהומים אמיתיים עם 19 virions, 20. בסך הכל, את שיטות הנוכחי מהווה צעד משמעותי קדימה בתחום של ביולוגיה מולקולרית norovirus לספק לנו את הכלים לחקור את התפקידים תפקודית של חלבונים ונשמר מוטיבים רנ&quot;א ב הגנום norovirus. גישות אלה כבר בשילוב עם גבמודל עכבר urrent זמין הראו כי MNV התאושש cDNA זיהומיות יכול לגרום לזיהום קטלני של&gt; 80% STAT1-/ - העכברים בתוך פחות מ -10 ימים 4, 21. תוך שימוש במערכת זו אנו התאוששו קיימא מוטציות norovirus Murine של החלבון capsid של מערכת polypyrimidine מעורב מחייב גורמים מארחים שונים (PTB ו PCBP) המציגים פנוטיפים נחלש מעט ב 21 vivo, 22. בנוסף, הראו לאחרונה כי וירוסים חסרי יכולת לבטא את החלבון VF1 מ ORF4 ביעילות לשכפל תרבית תאים אבל שוב צמצמו ארסיות בעכברים לגבי WT MNV 8. מחקרים אלו מעודדים אותנו לעצב גרסאות נחלש noroviruses של אדם בהתבסס על מחקרים MNV אשר יכול להיחקר כמועמדים פוטנציאליים לחיסון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ליתיום כלוריד משקעים פתרון </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA פתרון האחסון </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 התסריט </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G תקרת מערכת </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Transfection ניאון מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Transfection ניאון מערכת הערכה </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM אני </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> 2000 Lipofectamine transfection מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 ננו ערכת </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 דוoanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA וטיהור ג&#39;ל ערכת Band </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX גדול Scale-RNA ייצור System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Noroviruses האדם אחראים לרוב המקרים של גסטרואנטריטיס האנושי (GE) ברחבי העולם, הם הבעיה חוזרת בסביבות שבהן בקשר הדוק אדם אל אדם לא ניתן להימנע מכך 1, 2. בשנים האחרונות עלייה בשכיחות של התפרצויות בבתי חולים דווחה, לגרום לשיבושים משמעותיים והיכולת המבצעית שלהם, כמו גם הפסדים כלכליים גדולים. זיהוי של גישות אנטי החדשים הייתה מוגבלת בשל חוסר היכולת של האדם להשלים noroviruses זיהום פרודוקטיבי תרבית תאים 3. הבידוד לאחרונה norovirus Murine (MNV), קשורה קשר הדוק norovirus האנושי 4 אך ניתן מופצות בתאים 5 פתחה אפיקים חדשים לחקר אלה פתוגנים 6, 7. תוצאות MNV שכפול בסינתזה של הגנומי חדש במובן החיובי subgenomic מולקולות רנ&quot;א, האחרון שבהם מתאים תי האחרוןrd של הגנום הויראלי (איור 1). MNV מכיל ארבע מסגרות שונות הקריאה פתוחים (ORFs), מתוכם ORF1 מעסיק את רוב הגנום מקודד שבע ללא חלבונים מבניים (ns1-7) שוחרר מבית מבשר polyprotein. ORF2 ו ORF3 נמצאים בתוך האזור RNA subgenomic ו לקודד את החלבונים קפסיד (VP1 ו VP2, בהתאמה) (איור 1). לאחרונה, זיהינו כי ORF4 נוסף חופפים ORF2 אבל בתוך מסגרת קריאה שונה הוא פונקציונלי מקודד עבור גורם ארסיות המיטוכונדריה מקומי (VF1) 8. שכפול וירוסים תחושת חיוביות רנ&quot;א, כולל noroviruses, מתרחש בציטופלסמה וכתוצאה מכך סינתזה של הגנום חדשים הסיר את המיכסה RNA. כדי לקדם את התרגום ויראלית, וירוסים לנצל אסטרטגיות שונות שמטרתן גיוס חלבון הסלולר סינתזה מכונות 9-11. מעניין לציין, תרגום norovirus הוא מונע על ידי VPg רב תכליתיים חלבונים פריימר ויראליקשור קוולנטית לקצה &#39;5 של שני RNAs גנומית subgenomic 12-14. זה מנגנון מתוחכם של התרגום עשוי להיות גורם מרכזי היעילות המוגבלת של התאוששות ויראלי ידי הפוכה הגישות המקובלות גנטיקה. כאן אנו מדווחים על שתי אסטרטגיות שונות המבוססות על הדור של Murine norovirus-1 (המכונה MNV בזאת) תעתיקים כתרים בסוף &quot;5. אחת השיטות כרוכה הן סינתזה במבחנה מכסת של רנ&quot;א נגיפי, ואילו הגישה השנייה כרוכה שעתוק של MNV cDNA בתאים המבטאים T7 רנ&quot;א פולימרז. הזמינות של מערכות אלה גנטיקה הפוכה לחקר MNV ומודל חיה קטנה סיפקה יכולת חסרת תקדים לנתח את התפקיד של רצפים ויראליים שכפול בפתוגנזה 15-17.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Noroviruses הם אחד הגורמים העיקריים של הקיבה והמעיים עדיין בטכניקות מולקולריות לאפיון שלהם עדיין חדש יחסית. כאן אנו מדווחים על שתי גישות שונות גנטיקה הפוכה להתאוששות יעילה של norovirus Murine (MNV), הנציג היחיד של סוג זה אשר ניתן מופצות על תרבית תאים.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Assay רובד לnorovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...