Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
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Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di studio Wellcome Trust senior assegnato a Ian Goodfellow, e Marie Curie Intra European Fellowship (7 ° PQ Consiglio europeo della ricerca) ha assegnato ad Armando Arias. Vorremmo ringraziare Io Hong Cheong, il dottor Rebecca Robey e il dottor Mike Skinner per averci dato il permesso di utilizzare il loro bioanalyser Agilent e contribuendo con l&#39;esecuzione campioni di RNA.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Qui abbiamo illustrato due differenti approcci inverse genetici che permettono il recupero di MNV infettiva in coltura cellulare. Sia avvicina efficacemente bypassare il requisito assoluto per il collegamento covalente del VPG alla estremità 5 &#39;del genoma di RNA virale attraverso la generazione del ridotte trascritti MNV che vengono poi riconosciuti dai ribosomi cellulari. Trascrizione in vitro seguita da enzimaticamente tappatura è più efficiente in il recupero di MNV virulenta della trascrizione di plasmidi infettive in cellule esprimenti T7 RNA polimerasi, in cui i trascritti può essere chiuso da gli enzimi FPV tappatura. Titoli virali recuperati con questi sistemi genetica inversa sono simili a quelle ottenute mediante trasfezione di virali VPG-linked RNA purificati da colture di cellule infette 17 (Figura 5). La transfezione di capped MNV RNA in cellule permissive Raw264.7 rende un titolo virus solo l&#39;1-log inferiore esperimenti di transfection di RNA totale da cellule infette contenenti virale VPG-linked RNA (Figura 5). Questo fatto incoraggia ulteriori indagini per determinare se l&#39;aggiunta di una molecola VPG alla estremità 5 &#39;di trascritti generati da questi sistemi può comportare un aumento rese virali che possono rivelare aspetti funzionali sottostanti infettività MNV in cellule associate a VPG. Tuttavia, consideriamo questo sistema genetica inversa come una altamente efficiente comparabile ad altri virus RNA genetica inversa sistemi attualmente utilizzati in cui l&#39;RNA trascritto in vitro permette il recupero dei titoli solo 10-100 inferiori nelle infezioni reali con virioni 19, 20. Nel complesso, le metodologie attuali costituiscono un significativo passo avanti nel campo della biologia molecolare e norovirus fornirci gli strumenti per indagare i ruoli funzionali di proteine ​​e RNA motivi conservati nei genomi di norovirus. Questi approcci sono già stati combinati con cmodello di topo ATTUALE a disposizione e hanno dimostrato che MNV recuperato da cDNA infettiva è in grado di causare l&#39;infezione letale di&gt; 80% STAT1-/ - topi in meno di 10 giorni 4, 21. Facendo uso di questo sistema abbiamo recuperato mutanti vitali norovirus murini della proteina del capside e di un tratto polypyrimidine coinvolto nel legame di fattori diversi host (PTB e PCBP) che mostrano un fenotipo alquanto attenuati in vivo 21, 22. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che i virus che mancano della capacità di esprimere la proteina da VF1 ORF4 efficiente replicarsi nelle cellule in coltura, ma ancora una volta hanno ridotto la virulenza nei topi rispetto al WT MNV 8. Questi studi ci incoraggiano a progettare versioni attenuate di norovirus umani sulla base di studi MNV che potrebbero essere indagati come potenziali candidati vaccini.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di litio precipitazioni </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA soluzione di storage </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 sceneggiatura </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Capping sistema </td><td> Epicentre Biotecnologie </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Trasfezione sistema Neon </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon trasfezione kit sistema </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfection Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA e Kit Banda Gel Purificazione </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale Production System-T7 RNA </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Norovirus umani sono responsabili della maggior parte dei casi di gastroenterite umana (GE) a livello mondiale e sono problema ricorrente in ambienti dove vicino da persona a persona di contatto non possono essere evitati 1, 2. Negli ultimi anni un aumento nell&#39;incidenza di focolai negli ospedali è stata riportata, causando interruzioni significative per la loro capacità operativa nonché grandi perdite economiche. L&#39;identificazione di nuovi approcci antivirali è stato limitato a causa dell&#39;incapacità di norovirus umani per completare una infezione produttiva in coltura cellulare 3. L&#39;isolamento recente di un norovirus murino (MNV), strettamente legato al norovirus umana 4, ma che può essere propagato in cellule 5 ha aperto nuove strade per lo studio di questi patogeni 6, 7. Risultati replica MNV nella sintesi di nuovo genomico senso positivo e subgenomici molecole di RNA, l&#39;ultimo dei quali corrisponde all&#39;ultimo THIRd del genoma virale (Figura 1). MNV contiene quattro diversi telai di lettura aperti (ORF), di cui ORF1 occupa la maggior parte del genoma e codifica sette proteine ​​non strutturali (NS1-7) rilasciati da un precursore poliproteina. ORF2 e ORF3 sono contenuti all&#39;interno della regione subgenomico RNA e codificano le proteine ​​del capside (VP1 e VP2, rispettivamente) (Figura 1). Recentemente, abbiamo identificato che ORF4 ulteriore sovrapposizione ORF2, ma in una cornice diversa lettura è funzionale e codifica per un fattore di virulenza mitocondriale localizzata (VF1) 8. Replica di virus RNA senso positivi, compresi norovirus, avviene nel citoplasma risultante nella sintesi di nuovi livellate genomi di RNA. Per promuovere traduzione virale, i virus sfruttano diverse strategie volte al reclutamento del macchinario cellulare sintesi proteica 9-11. È interessante notare, traduzione norovirus è guidato dalla proteina virale multifunzionale-primer VPGlegata covalentemente al 5 &#39;di entrambi RNA genomici e subgenomico 12-14. Questo sofisticato meccanismo di traduzione è probabile che sia un fattore importante nella scarsa efficienza di recupero virale tradizionali approcci di genetica inversa. Riportiamo due diverse strategie basate sulla generazione di norovirus murino-1 (indicato come MNV qui allegata) trascritti limitato al 5 &#39;. Uno dei metodi coinvolge sia sintesi in vitro e tappatura di RNA virale, mentre il secondo approccio implica la trascrizione di MNV cDNA in cellule esprimenti T7 RNA polimerasi. La disponibilità di questi sistemi genetica inversa per lo studio di MNV e un modello animale piccolo ha fornito una capacità senza precedenti per sezionare il ruolo di sequenze virali di replicazione e patogenesi 15-17.

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

I Norovirus sono una delle principali cause di gastroenterite ancora tecniche molecolari per la loro caratterizzazione sono ancora relativamente nuovi. Riportiamo due diversi approcci di genetica inversa per il recupero efficiente dei norovirus murino (MNV), l&#39;unico membro di questo genere che possono essere propagate in coltura cellulare.

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