Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
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本研究では、イアン·グッドフェローに授与ウェルカムトラストシニア·フェローシップによって資金を供給し、マリーキュリーイントラヨーロッパのフェローシップ（FP7欧州研究評議会）は、アルマンド·アリアスに授与されました。私達は私達に彼らのAgilentのbioanalyserを使用する許可を与え、RNAサンプルを実行すると助けるためにイオ香港チョン博士レベッカロービーとDrマイクスキナーに感謝します。

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. 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Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. 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Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは、細胞培養における感染MNVの回復を可能にする2つの異なった逆遺伝学的アプローチを説明しました。両方を効果的に近づくし、細胞リボソームによって認識されるキャップMNVの転写産物の生成を介したウイルスRNAゲノムの5 &#39;末端にVPGの共有結合のための絶対的な要件をバイパスします。in vitro転写酵素キャッピング続いて、より効率的です。転写物はFPVキャッピング酵素によってキャップされるかもしれないT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞に感染するプラスミドの転写より感染MNVの回復。これらの逆遺伝学システムで回収し、ウイルス力価は、感染した細胞培養液17（ 図5）から精製したウイルスVPG-結合型RNAのトランスフェクションによって得られたこれらに類似しています。寛容なRAW264.7細胞に覆われたMNV RNAのトランスフェクションは、transfectioを含む実験より1つだけログ低いウイルス力価をレンダリングn個のウイルスVPG-結合型RNA（ 図5）を含む感染細胞からのトータルRNA。この事実は、これらのシステムによって生成された転写産物の5 &#39;末端にVPG分子の添加はVPGに関連付けられている細胞にMNV感染性の根底にある機能的側面を明らかにすることが増加したウイルスの収率につながるかどうかを判断するためにさらなる調査を奨励しています。他のRNAウイルスに匹敵する高効率のいずれかの遺伝システムは現在、in vitro転写RNA のウイルス粒子19、20と実際の感染症に比べて唯一の10から100まで低価の回復を可能にするに使用される逆にそれにもかかわらず、我々は、このリバースジェネティクス系を考えています。 全体として、現在の方法論は、ノロウイルスの分子生物学の分野で大きな前進を構成し、ノロウイルスのゲノム中のタンパク質と保存されたRNAモチーフの機能的役割を調べるためのツールを提供してくれる。これらのアプローチは、既にCと組み合わされています10日未満4、21 -マウスurrentマウスモデル使用可能で、MNVが感染性cDNAから回収されたことが示されているが&gt; 80％STAT1-/の致死的感染を引き起こすことができます。我々はキャプシドタンパク質のおよび in vivo 21、22 でやや減衰の表現型を示すさまざまな宿主因子（PTBとPCBP）の結合に関与するポリピリミジン管の生存マウスノロウイルスの変異体を回復したこのシステムを活用した。さらに、我々は最近、ORF4からVF1タンパク質を発現する能力を欠いているウイルスが効率的に細胞培養で複製が再びWT MNV 8に対してマウスにおける病原性が低下していることを明らかにした。これらの研究は、私たちは潜在的なワクチン候補として検討することができMNVの研究に基づいて人間のノロウイルスの弱毒化のバージョンを設計することをお勧めします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>塩化リチウム沈殿ソリューション</td><td> Ambionの</td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA·ストレージ·ソリューション</td><td> Ambionの</td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7スクリプト</td><td> Ambionの</td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7Gキャッピングシステム</td><td> EPICENTREバイオテクノロジー</td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td>ネオントランスフェクション·システム·キット</td><td>インビトロジェン</td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td>のOpti-MEM I </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985070 </td></tr><tr><td>リポフェクトアミン2000トランスフェクション試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td>アジレント·RNA 600ナノキット</td><td>アジレント</td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100バイオアナライザの双方向oanalyzer </td><td>アジレント</td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNAとジェルバンド精製キット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX大規模RNA生産システム-T7 </td><td>プロメガ</td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

人間のノロウイルスはヒトの胃腸炎（GE）は、世界中のほとんどの責任があると近い人から人への接触が1、2を回避することはできません環境での再発問題である。ここ数年の間に病院内で感染の発生率の増加は、その運用能力だけでなく、大規模な経済的損失に大きな混乱を引き起こして、報告されている。新たな抗ウイルスアプローチの識別は、細胞培養3で生産的な感染症を完了するには、人間のノロウイルスの無力のために限られていました。密接に人間のノロウイルス4に関連したマウスノロウイルス（MNV）、最近の分離がどのセル5に伝播することができますが、これらの病原体6,7の調査のための新しい道を開いた。 新しい正のセンスゲノムおよびサブゲノムRNA分子の合成MNVの複製の結果は、後者の最後のTHIに対応ウイルスゲノムのRD（ 図1）。 MNVは、ORF1は、ゲノムの大部分を占有し、ポリプロテイン前駆体から放出される7つの非構造タンパク質（NS1-7）をコードする4つの異なるオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれています。 ORF2とORF3はサブゲノムRNA領域内に含まれており、キャプシドタンパク質（それぞれVP1およびVP2）（ 図1）エンコードされています。最近、我々はORF2が重複し、追加ORF4を同定したが、別のリーディングフレームで機能的であり、ミトコンドリアのローカライズされた病原性因子（VF1）8にエンコードしています。 ノロウイルスを含む正センスRNAウイルス、の複製は、新しい上限​​なしRNAゲノムの合成で得られる細胞質内で行われます。ウイルスの翻訳を促進するために、ウイルスが細胞のタンパク質合成機械9-11募集を目的としたさまざまな戦略を利用する。興味深いことに、ノロウイルスの変換は多機能ウイルスのタンパク質プライマーVPGによって駆動され共有ゲノムおよびサブゲノムRNAを12から14の両方の5 &#39;末端にリンクされています。翻訳のこの洗練されたメカニズムは、従来の逆遺伝学的アプローチによるウイルス回収の限られた効率の主要な要因となる可能性があります。 ここでは、5 &#39;末端にキャップされたマウスノロウイルス-1（同封MNVと呼ばれる）の転写産物の生成に基づいて2つの異なる戦略を報告します。 2番目のアプローチは、T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞のcDNA MNVの転写を伴うのに対し、いずれかの方法では、in vitroでの合成およびウイルスRNAのキャップの両方が含まれます。 MNVと小動物モデルの研究のためのこれらの逆遺伝学·システムの可用性は、レプリケーションと病因15から17にウイルス配列の役割を分析するための前例のない能力を提供しています。

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

ノロウイルスは胃腸炎の主要原因である、まだそれらの特性評価のための分子技術はまだ比較的新しいです。ここでは、マウスノロウイルス（MNV）、細胞培養で増殖させることができるこの属の唯一のメンバーを効率的に回収するための2つの異なる逆遺伝学のアプローチを報告します。

感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

マウスノロウイルスのプラークアッセイ

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

下流の単一細胞分析のため尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の分離

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...