Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Это исследование финансировалось Wellcome Trust старший Стипендия присуждается Ян Гудфеллоу, и Мари Кюри Intra европейской стипендии (FP7 Европейский исследовательский совет) присуждена Армандо Ариас. Мы хотели бы поблагодарить Ио Гонконга Чонг, доктор Ребекка Роби и доктор Майк Скиннер за предоставление разрешения на использование их Agilent bioanalyser и помогает с управлением РНК образцов.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li><li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses.">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li><li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus.">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection.">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li><li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4.">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).</li><li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5'+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs.">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs:+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site.">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li><li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components.">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Здесь показаны два разных обратный генетические подходы, которые позволяют восстановления инфекционных Многовершинном в клеточной культуре. Оба подхода эффективно обходить абсолютное требование к ковалентно связь ВПГ на 5 &#39;конце вирусного генома РНК через поколение крышками стенограммы Многовершинном, которые затем признаются сотовые рибосом. В пробирке транскрипции следует ферментативно покрытие является более эффективным в Восстановление инфекционных Многовершинном, чем транскрипции инфекционных плазмиды в клетки, экспрессирующие Т7 РНК-полимеразы, в которой стенограммы может быть ограничен по FPV укупорки ферментов. Вирус титры восстановить с помощью этих систем обратного генетики похожи на эти получены путем трансфекции вирусных ВПГ-связанной РНК очищали от инфицированных клеточных культурах 17 (рис. 5). Трансфекции крышками Многовершинном РНК в клетках разрешительной Raw264.7 оказывает титр вируса только 1-журнала ниже, чем эксперименты с transfectioп суммарной РНК из инфицированных клеток, содержащих вирусные ВПГ-связанной РНК (рис. 5). Этот факт стимулирует дальнейшие исследования, чтобы определить, является ли добавление ВПг молекулы к 5 &#39;концу стенограммы, порожденная этими системами может привести к росту урожайности вирус, который может выявить функциональные аспекты, лежащие в основе Многовершинном инфекционности в клетках, связанных с ВПг. Тем не менее, мы считаем это система обратного генетики как весьма эффективный, сравнимый с другими РНК-содержащих вирусов с помощью обратной генетики систем в настоящее время используется, в котором в пробирке транскрипции РНК позволяет восстановления титры только 10-100 ниже, чем в реальной инфекции с 19 вирионов, 20. В целом, текущие методологии представляют собой значительный шаг вперед в области норовирус молекулярной биологии и предоставить нам инструменты для исследования функциональной роли белков и консервативных мотивов в РНК норовируса геномов. Эти подходы уже в сочетании с сurrent мышиной модели доступны и показали, что МНВ оправилась от инфекционной кДНК может привести к смертельной инфекции&gt; 80% STAT1-/ - мышей менее чем за 10 дней, 4, 21. Используя эту систему, мы восстановили жизнеспособное мышиных мутантов норовирус в капсид белков и полипиримидиновых путей, участвующих в связывании различных факторов организма (ПТБ и PCBP), которые отображают несколько ослабленный фенотипов в 21 естественных, 22. Кроме того, мы недавно показали, что вирусы не имея возможности выразить VF1 белка из ORF4 эффективно размножаться в культуре клеток, но опять сократили вирулентности у мышей в отношении WT Многовершинном 8. Эти исследования побуждают нас разрабатывать ослабленные версии норовирусов человека на основе исследования Многовершинном, которые могут быть исследованы в качестве потенциальных кандидатов вакцины.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Хлорид лития осадков решение </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> РНК решение для хранения данных </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 сценарий </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G укупорки системы </td><td> Эпицентр биотехнологии </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon системы трансфекции </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon комплект системы трансфекции </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM я </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Липофектамина 2000 Трансфекция реагентов </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent РНК 600 Nano комплект </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 биoanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX ПЦР ДНК и гель для очистки группы Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX крупномасштабных РНК Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Норовирусов человека ответственны за большинство случаев человека гастроэнтерит (GE) по всему миру и являются актуальной проблемой в условиях, когда близкий человек к человеку контакта не избежать 1, 2. За последние несколько лет рост заболеваемости вспышек в больнице сообщили, что приводит к значительным сбоям в их оперативных возможностей, а также большие экономические потери. Выявление новых противовирусных подходов был ограничен в связи с неспособностью человека норовирусов завершить продуктивной инфекции в культуре клеток 3. Недавнее выделение мышиных норовирус (МНВ), тесно связаны с человеческой норовирус 4, но которые могут быть распространены в клетках 5, открыл новые возможности для изучения этих патогенов 6, 7. МНВ репликации приводит к синтезу новых позитивных чувств и геномной subgenomic молекул РНК, последняя из которых соответствует последним Тхим вирусного генома (рис. 1). МНВ содержит четыре различных открытых рамок считывания (ORF,), из которых ORF1 занимает большую часть генома и кодирует семь неструктурных белков (NS1-7), освобождаются от полипротеина предшественника. ORF2 и ОРС3 содержатся в subgenomic региона РНК кодируют белки капсида (VP1 и VP2, соответственно) (рис. 1). Недавно мы определили, что дополнительные ORF4 перекрытия ORF2, но в другом кадре чтение функциональное и кодирует митохондриальную локализованных факторов вирулентности (VF1) 8. Репликация на положительном смысле РНК-содержащих вирусов, в том числе норовирусы, происходит в цитоплазме в результате синтеза новых раскрытый геном РНК. Чтобы способствовать вирусная перевод, вирусы использовать различные стратегии, направленные на вербовку клеточные механизмы синтеза белка 9-11. Интересно, что норовирус перевод обусловлен многофункциональный вирусный белок-премьера ВПгковалентно связан с 5 &#39;конца и геномной РНК и subgenomic 12-14. Этот сложный механизм перевода, вероятно, будет основным фактором в ограниченной эффективности вирусного восстановления обычной обратной подходы генетики. Здесь мы приводим две различные стратегии, основанные на генерации мышиных норовирус-1 (именуемые Многовершинном при этом) стенограммы максимум 5 &#39;конца. Одним из методов включает в себя как в пробирке синтеза и укупорки вирусной РНК, в то время как второй подход влечет за собой транскрипцию Многовершинном кДНК в клетках, экспрессирующих Т7 РНК-полимеразы. Наличие этих систем обратного генетики для изучения МНВ и маленькая модель животного предоставил беспрецедентную возможность анализировать роль вирусных последовательностей в репликации и патогенезе 15-17.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Норовирусы являются основной причиной гастроэнтерита еще молекулярных методов для их характеристики все еще относительно новое. Здесь мы сообщаем о двух различных подходах обратной генетики для эффективного восстановления мышей норовирус (МНВ), единственный член этого рода, которые могут быть размножены в культуре клеток.

Обратной генетики опосредованного восстановления инфекционных мышей норовирус

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Использование обратной генетики манипулировать АПЛ Ген Лихорадка Рифт-Валли Вирус MP-12 Штамм для повышения безопасности и эффективности вакцин

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Бляшек на мышиной норовирус

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Органоиды как модель для инфекционных болезней: Культура человека и мыши желудка органоидов и Микроинъекция Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Подготовка мышиных подчелюстной слюнной железы вертикально прижизненной микроскопии

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Изоляция одной внутриклеточных бактериальных сообществ, генерируется из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей анализа течению одноклеточного

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...