Name: reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Denna forskning har finansierats av ett Wellcome Trust Senior Fellowship tilldelades Ian Goodfellow, och en Marie Curie Intra European Fellowship (FP7 European Research Council) tilldelas Armando Arias. Vi vill tacka Io Hong Cheong, Dr Rebecca Robey och Dr Mike Skinner för att ge oss tillstånd att använda sin Agilent bioanalyser och hjälpa med rinnande RNA prover.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li><li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses.">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li><li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus.">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection.">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li><li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4.">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).</li><li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5'+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs.">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs:+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site.">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li><li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components.">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Här har vi illustrerat två olika omvända genetiska metoder som tillåter återvinning av smittsamma MNV i cellkultur. Båda tillvägagångssätten effektivt förbikoppla det absoluta kravet på kovalent bindning av Vpg till 5 &#39;änden av det virala RNA-genomet genom generering av kapslade MNV transkript som sedan känns igen av det cellulära ribosomer. In vitro-transkription följt av enzymatiskt capping är mer effektivt i återvinning av smittsamma MNV än transkription av smittsamma plasmider i celler som uttrycker T7 RNA-polymeras, där utskrifter kan tillslutas med FPV capping enzymer. Virustitrar återvunna med dessa omvänd genetik system är liknande den som uppnås genom transfektion av virala Vpg-länkade RNA renad från infekterade cellkulturer 17 (figur 5). Transfektion av kapslade MNV RNA till tillåtande Raw264.7 celler gör ett virus titer endast 1-log lägre än försök med transfection av total RNA från infekterade celler som innehåller virus Vpg-linked-RNA (Figur 5). Detta faktum uppmuntrar ytterligare undersökningar för att bestämma huruvida tillsatsen av en VPG molekyl till 5 &#39;änden av transkript som genereras av dessa system kan resultera i ökade virusutbyten som kan avslöja funktionella aspekter underliggande MNV infektivitet i celler som är associerade till Vpg. Ändå ser vi detta omvända genetik system som en mycket effektiv en jämförbar med andra RNA-virus omvänd genetik som för närvarande används som in vitro transkriberade RNA tillåter återvinning av titrar bara 10-100 lägre än i verkliga infektioner med virioner 19, 20. Överlag är de nuvarande metoderna utgör ett betydande steg framåt när det gäller norovirus molekylärbiologi och ger oss verktyg att undersöka funktionella roller proteiner och bevarade RNA motiv i norovirus genom. Dessa metoder har redan kombinerat med cktuellt musmodell tillgängliga och har visat att MNV utvinnas från infektiös cDNA kan orsaka livshotande infektion av&gt; 80% STAT1-/ - möss på mindre än 10 dagarna 4, 21. Utnyttjar detta system har vi utvanns viabla murina norovirus mutanter av den kapsidprotein och ett polypyrimidine tarmkanalen involverad i bindningen av olika värdfaktorer (PTB och PCBP) som uppvisar ett något försvagade fenotyper in vivo 21, 22. Dessutom har vi nyligen visat att virus som saknar förmågan att uttrycka VF1 proteinet från ORF4 effektivt replikera i cellkultur men återigen har minskat virulens hos möss med avseende på WT MNV 8. Dessa studier uppmuntra oss att utforma försvagade versioner av humant norovirus som bygger på MNV studier som kunde undersökas som potentiella vaccinkandidater.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Litiumklorid fällningslösningen </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA lagringslösning </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 skript </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Capping System </td><td> Epicentrum Bioteknik </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon transfektionssystem </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon transfektionssystem kit </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfektion Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 nano-kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 dubbelriktadeoanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR-DNA och gelband Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> Ribomax Large Scale RNA Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Mänskliga norovirus är ansvariga för de flesta fall av mänsklig gastroenterit (GE) över hela världen och är återkommande problem i miljöer där närstående person till person kontakt inte kan undvikas 1, 2. Under de senaste åren en ökning av incidensen av utbrott på sjukhus har rapporterats orsaka betydande störningar i sin operativa kapacitet samt stora ekonomiska förluster. Identifiering av nya antivirala strategier har varit begränsad på grund av oförmågan hos humana norovirus att fullborda en produktiv infektion i cellkultur 3. Den senaste isoleringen av en mus norovirus (MNV), nära besläktat med humaninsulin norovirus 4, men som kan förökas i celler 5 har öppnat nya vägar för utredning av dessa patogener 6, 7. MNV replikering resulterar i syntes av nya positiv bemärkelse genomiska och subgenomiska RNA-molekyler, motsvarar den senare för att den sista third av det virala genomet (fig 1). MNV innehåller fyra olika öppna läsramar (ORF), varav ORF1 upptar det mesta av genomet och kodar sju icke-strukturella proteiner (NS1-7) som frigörs från ett polyprotein föregångare. ORF2 och ORF3 är inneslutna i den subgenoma RNA-regionen och kodar för kapsidproteinerna (VP1 och VP2, respektive) (Figur 1). Nyligen har vi identifierat att ytterligare ORF4 överlappande ORF2 men i en annan läsram är funktionell och kodar för ett mitokondriellt lokaliserat virulensfaktor (VF1) 8. Replikation för positiv sens-RNA-virus, däribland norovirus, äger rum i cytoplasman vilket resulterar i syntes av nya icke-kåpförsedda RNA-genom. För att främja viral översättning, virus utnyttjar olika strategier för att rekrytera det cellulära maskineri proteinsyntes 9-11. Intressant nog är norovirus översättning drivs av den multifunktionella virala protein-primern Vpgkovalent bunden till 5 &#39;änden av båda genomiska och subgenomiska RNA 12-14. Denna sofistikerade mekanism översättning är sannolikt en viktig faktor i den begränsade effektiviteten i viral återhämtning genom konventionella omvänd genetik metoder. Här rapporterar vi två olika strategier som bygger på produktion av murina norovirus-1 (benämnd MNV härmed) transkript maximerat till 5 &#39;änden. En av de metoder involverar både in vitro syntes och utjämningen av viralt RNA, medan den andra metoden innebär transkription av MNV cDNA i celler som uttrycker T7 RNA-polymeras. Tillgängligheten av dessa omvänd genetik system för studium av MNV och en liten djurmodell har tillhandahållit en oöverträffad möjlighet att dissekera roll virala sekvenser i replikation och patogenes 15-17.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Norovirus är en viktig orsak till gastroenterit ännu molekylära tekniker för deras karakterisering fortfarande är relativt nytt. Här rapporterar vi två olika omvänd genetik metoder för effektiv återvinning av mus norovirus (MNV), den enda medlemmen av detta släkte som kan förökas i cellkultur.

Omvänd genetik Medierad Återvinning av infektiös Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Använda omvänd genetik att manipulera NSS Gene i Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain att förbättra vaccin säkerhet och effekt

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plackanalys för murin Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolera och immunofärgning Lymfocyter och dendritiska celler från murina Peyers plack

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-medierad Forward Genetics Screening för Identifiering av gener involverade i Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell för Infektionssjukdomar: Culture of Human och Murina mage Organoids och mikroinjektion av Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering och Flödescytometriska karakterisering av murina tunntarms lymfocyter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

En metod för att bedöma Fc-medierad effektor funktioner induceras av influensa Hemagglutinin specifika antikroppar

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Beredning av murina Submandibular spottkörteln för upprätt Intravital mikroskopi

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering av enda intracellulära bakteriella samhällen som genereras från en murin modell av urinvägsinfektion för nedströms Single-cell analys

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...