Name: constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM blev støttet af signalsystemet og Cellular forordning National Institute of Health uddannelse tilskud (T32 GM008759) og NIH Ruth L. Kirschstein PhD-stipendiat (CA165349-01). Vi vil gerne takke professor Michael Stowell (CU Boulder), professor Douglas Rees og professor Rob Phillips (Caltech) for deres uvurderlige kommentarer.

1. Liposompræparatet <ol><li> Hent et 20 ml hætteglas med en Teflon-foret hætte. </li><li> Rengør alle glasvarer og sprøjter med chloroform før brug for at forebygge forurening. </li><li> Overfør 100 ul af reagenskvalitet chloroform til hætteglasset under anvendelse af en 250 ul lufttæt glassprøjte. </li><li> Tilsættes 30 pi methanol af reagenskvalitet samme hætteglas under anvendelse af en 100 gl lufttæt glassprøjte. </li><li> Til fremstilling af en 2 mM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholin (POPC): phosphatidyl...

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Ved hjælp af Avestin Liposofast LF-50 ekstruder, vi vist, hvordan lille størrelse, er syntetiske liposomer fremstillet ved en tryk-styret system. Det er vigtigt at bemærke, at multilamellare vesikler dannes spontant efter liposom hydratisering, hvilket kan føre til produktion af små nanopartikler. Disse små multilamellare vesikler vil uundgåeligt strømme gennem det større polycarbonatmembran porestørrelse, hvilket heterogenitet i opløsninger af unilamellare vesikler fremstillet af et stort filter pore. Derfor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02.432-25ML </td><td> 95% stabilisatorer </td></tr><tr><td> High Grade Methanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 ekstruder </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipider </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polycarbonat Porer </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm diameter </td></tr><tr><td> Dræn diske PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm diameter </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Liposomer er kunstigt fremstillet vesikler bestående af naturlige og syntetiske phospholipider, som er almindeligt anvendt som en cellemembran efterligner platform til at undersøge protein-protein og protein-lipid-interaktioner 3, monitor drug delivery 4,5, og indkapsling 4. Phospholipider naturligt skabe buede lipiddobbeltlag, adskille sig fra en micelle. 6 Liposomer traditionelt klassificeres efter størrelse og antallet af dobbeltlag, dvs store unilamellare vesikler (LUV&#39;er) og små unilamellære vesikler (SUV&#39;er) og multilamellare vesikler (MLVer) 7. Især er fremstillingen af homogene liposomer af forskellige størrelser vigtigt at studere membran krumning, der spiller en afgørende rolle i cellesignalering, endo-og exocytose, membranfusion, og protein handel 8. Adskillige grupper analysere, hvordan proteiner anvendes til at modulere processer, der involverer membran krumning og derved fremstille liposomer med diametre under 100 - 400nm undersøge deres adfærd på cellefunktioner 3. Andre fokuserer på liposom-medikamentindkapslingseffektivitet, studere liposomer som køretøjer til at gennemføre og levere et lægemiddel af interesse 9. Drug indkapsling kan opnås som angivet under liposomdannelse 9. Vores ekstruderingstrin bør ikke påvirke det indkapslede lægemiddel til to grunde bør nemlig (1) lægemiddelindkapsling opnås inden for dette trin og (2) liposomer bør bevare deres naturlige biofysiske stabilitet sikkert bærer lægemidlet i den vandige kerne. Disse forskningsmål yderligere antyder behovet for en optimeret fremgangsmåde til at designe stabile sub-micron lipidvesikler. Ikke desto mindre har de nuværende liposompræparat teknologi (lydbehandling 10, fryse-og-optønings-10, sedimentering) ikke tillader fremstilling af liposomer med stærkt krum overflade (dvs. diameter &lt;100 nm) med høj konsistens og effektivitet 10,5, hvilket begrænser biofysiske studier af en emerging området membran krumning sensorer. Heri, præsenteres en robust fremstillingsmetode til en række forskellige biologisk relevante liposomer. Manuel ekstrudering med gastætte sprøjter og polycarbonatmembraner 10,5 det er almindelig praksis, men heterogenitet ofte observeres ved anvendelse af porestørrelser under 100 nm på grund af grund af variationer af manuelt påført tryk. Vi anvendte en konstant trykstyret ekstruderingsapparat til fremstilling af syntetiske liposomer, hvis diametre ligger mellem 30 og 400 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) 10, elektronmikroskopi 11 og nanopartikler sporing analyse (NTA) 12 blev anvendt til kvantificering af liposomstørrelser som beskrevet i vor protokol med kommercielt polystyren (PS) perler, der anvendes som en kalibreringsstandard. En næsten lineær korrelation blev observeret mellem de anvendte porestørrelser og bestemmes eksperimentelt liposomer, hvilket indikerer high fidelity for vores trykstyret liposomfremstilling opfyldtHøder. Vi har desuden vist, at denne lipidvesikelpræparat metode er generelt anvendelig, uafhængigt af forskellige liposom størrelser. Endelig har vi også vist i en tidsforløbsundersøgelse at disse fremstillede liposomer var stabile i op til 16 timer. Et repræsentativt nanostørrelse liposompræparat protokol er vist nedenfor.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Denne protokol beskrives en ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af lipidvesikler af sub-micron størrelser med en høj grad af homogenitet. Denne fremgangsmåde anvender en trykstyret system med kontrolleret nitrogen strømningshastigheder for liposompræparat. Lipid præparat<sup&gt; 1,2</sup&gt; Vil liposom ekstrudering og størrelse karakterisering blive præsenteret heri.

Konstant tryk-styret Ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af nano-størrelse lipidvesikler

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret metode til forberedelse af type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Udarbejdelse af Mica Understøttet lipiddobbeltlagenes for High Resolution optisk mikroskopi Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Film Ekstrudering af<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / Hvedegluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantificering af udvalgte kynureniner analyseret af flydende kromatografi-massespektrometri i medium indsamlet fra kræftcellekulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...