Name: constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) בפרס חדשנות שיתופית. לאם נתמך על ידי איתות נייד תקנה המכון הלאומי לבריאות אימון מענק (T32 GM008759) ואת רות NIH ל Kirschstein קדם דוקטורט (CA165349-01). אנו רוצים להודות פרופ &#39;מיכאל Stowell (CU Boulder), פרופ&#39; דאגלס ריס ופרופ &#39;רוב פיליפס (קלטק) להערות יסולא בפז שלהם.

1. Liposome הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזור בקבוקון 20 מ&quot;ל עם מכסה זכוכית מצופה טפלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את כל כלי זכוכית מזרקים עם כלורופורם לפני השימוש כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μL של כלורופורם כי?...

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

שימוש Liposofast Avestin LF-50 extruder, הראינו עד כמה קטן בגודל, ליפוזומים מלאכותיים מוכנים באמצעות מערכת לחץ מבוקר. חשוב לציין כי שלפוחית ​​multilamellar ליצור באופן ספונטני לאחר הידרציה liposome, מה שעשוי להוביל לייצור של חלקיקים קטנים יותר. אלו שלפוחיות קטנות multilamellar בהכרח לזרום גודל גד?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% מייצבים </td></tr><tr><td> מתנול ציון גבוה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Extruder Liposofast LF-50 </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספוליפידים </td><td> AVANTI ליפידים פולאר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוליקרבונט הנקבוביות </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 מ&quot;מ קוטר </td></tr><tr><td> מסננים דיסקים PE </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 מ&quot;מ קוטר </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

ליפוזומים הם בועיות שהוכנו באופן מלאכותי המורכב פוספוליפידים טבעיים וסינתטיים הנמצאים בשימוש נרחב כמו קרום התא מחקה פלטפורמת ללמוד חלבונים חלבונים חלבונים שומנים בדם אינטראקציות 3, משלוח צג התרופה 4,5, ו 4 אנקפסולציה. פוספוליפידים באופן טבעי ליצור bilayers השומנים מעוקלים, להבדיל את עצמו מן micelle. 6 ליפוזומים מסווגים באופן מסורתי על ידי גודל ומספר bilayers, כלומר שלפוחית ​​unilamellar גדולות (&#39;לאב&#39;), שלפוחית ​​unilamellar קטנים (רכבי השטח) ואת שלפוחית ​​multilamellar (MLVs) 7. בפרט, הכנת ליפוזומים הומוגניות בגדלים שונים, חשוב ללמוד עקמומיות קרום זה ממלא תפקיד חיוני איתות התא, אנדו ו-exocytosis, איחוי קרום, וסחר חלבון 8. מספר קבוצות לנתח כיצד חלבונים משמשים לווסת את התהליכים הכרוכים עקמומיות הממברנה ובכך להכין ליפוזומים בקטרים ​​של פחות מ -100 - 400ננומטר ללמוד את ההתנהגות שלהם על פונקציות התא 3. אחרים מתמקדים אנקפסולציה liposome תרופות, לומד ליפוזומים כלי רכב לבצע ולספק סמים עניין 9. אנקפסולציה התרופה ניתן להשיג כפי שדווח במהלך היווצרות liposome 9. צעד שחול שלנו לא אמור להשפיע על התרופה Encapsulated משתי סיבות, כלומר (1) אנקפסולציה התרופה צריכה להיות מושגת לפני השלב הזה (2) ליפוזומים צריך לשמור על יציבות biophysical הטבעי שלהם, באופן מאובטח נושאת את התרופה הליבה מימית. מטרות אלה מחקר נוסף מצביעים על הצורך שיטת אופטימיזציה לעצב יציבים מיקרון משנה שלפוחית ​​השומנים. עם זאת, הטכנולוגיות הנוכחיות הכנה liposome (sonication 10, הקפאת-and-ההפשרה 10, שקיעה) לא מאפשרים הכנה של ליפוזומים עם משטח עקום מאוד (כלומר &lt;בקוטר 100 ננומטר) עם עקביות יעילות גבוהה 10,5, אשר מגביל את biophysical מחקרים של emergiבתחום ng של חישה עקמומיות קרום. כאן, אנו מציגים שיטת הכנה חזק עבור מגוון רחב של ליפוזומים רלוונטיות מבחינה ביולוגית. שחול ידני באמצעות גז חזק מזרקים וממברנות פוליקרבונט 10,5 היא מנהג נפוץ אך ההטרוגניות הוא נצפה לעיתים קרובות בעת השימוש גדלים הנקבוביות פחות מ -100 ננומטר בשל בשל השתנות של לחץ ידני מיושם. העסקנו מנגנון קבוע לחץ שבשליטת שחול להכין ליפוזומים סינתטיים אשר בקטרים ​​לנוע בין 30 ל 400 ננומטר. פיזור אור דינאמי (DLS) 10, 11 ו במיקרוסקופ אלקטרונים Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) 12 שימשו כדי לכמת את גודל liposome כמפורט בפרוטוקול שלנו, עם קלקר מסחרי (PS) חרוזים ששימשו כסטנדרט כיול. קשר ליניארי ליד נצפתה בין גודל הנקבוביות מועסק על ליפוזומים נקבע באופן ניסיוני, המעיד על איכות גבוהה של הכנה שלנו לחץ שבשליטת liposome נפגשוהוד. יתר על כן, הראינו כי שלפוחית ​​שומנים שיטת הכנת חלה באופן כללי, ללא תלות בגודל liposome שונים. לבסוף, אנו הוכיחו גם במחקר כמובן אז אלה ליפוזומים מוכנים היו יציבים עד 16 שעות. פרוטוקול נציג בגודל ננו הכנה liposome באה לידי ביטוי בהמשך.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

פרוטוקול זה מתאר שיטה שחול להכנת שלפוחית ​​השומנים של מיקרון משנה גדלים עם רמה גבוהה של הומוגניות. שיטה זו משתמשת במערכת לחץ מבוקר עם מבוקרים זרימת שיעורי חנקן להכנת liposome. הכנה שומנים בדם<sup&gt; 1,2</sup&gt;, שיחול liposome, ואפיון גודל יוצגו להלן.

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

סרטים שחול של<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / חיטה גלוטן תערובות

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית שומנים