Name: constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM ble støttet av signalering og Cellular forskrift National Institute of Health trening stipend (T32 GM008759) og NIH Ruth L. Kirschstein Pre-stipendiat (CA165349-01). Vi ønsker å takke professor Michael Stowell (CU Boulder), professor Douglas Rees og professor Rob Phillips (Caltech) for deres uvurderlige kommentarer.

1. Liposome Forberedelse <ol><li> Hente en 20 ml hetteglass med en Teflon-lined cap. </li><li> Rengjør alle glass og sprøyter med kloroform før bruk for å hindre forurensning. </li><li> Overføring 100 mL av reagens karakter kloroform til hetteglass med en 250 mL lufttett glass sprøyte. </li><li> Tilsett 30 mL av reagens karakter metanol til samme hetteglass med et 100 mL lufttett glass sprøyte. </li><li> For å forberede en 2 mm 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC): phosphatidylethanolamine (Pope): kolesterol l...

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Bruke Avestin Liposofast LF-50 Extruder, viste vi hvor liten størrelse, er syntetiske liposomer forberedt gjennom en trykk-kontrollert system. Det er viktig å merke seg at multilamellar vesikler danner spontant etter liposome hydrering, som kan føre til produksjon av mindre nanopartikler. Disse små multilamellar vesikler nødvendigvis vil strømme gjennom det større polykarbonat membranen porestørrelse, forårsaker heterogenitet i løsninger av unilamellar vesikler produsert av et stort filter pore. Derfor anbefal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% stabilisatorer </td></tr><tr><td> High Grade Metanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipider </td><td> Avanti polare lipider </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polykarbonat Porer </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm diameter </td></tr><tr><td> Drain plater PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm diameter </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Liposomer er kunstig utarbeidet vesikler som består av naturlige og syntetiske fosfolipider som er mye brukt som en cellemembran hermet plattform for å studere protein-protein og protein-lipid interaksjoner 3, monitor stoffet levering 4,5, og innkapsling fire. Fosfolipider naturligvis lage buede lipid bilayers, skille seg fra en miceller. 6 Liposomer er tradisjonelt klassifisert etter størrelse og antall bilayers, dvs. store unilamellar blemmer (LUVs), små unilamellar blemmer (SUVer) og multilamellar blemmer (MLVs) 7. Spesielt er utarbeidelse av homogene liposomer i ulike størrelser viktig for å studere membran kurvatur som spiller en viktig rolle i celle signalisering, endo-og eksocytose, membran fusion, og protein trafficking 8. Flere grupper analysere hvordan proteinene brukes til å modulere prosesser som involverer membran kurvatur og dermed forberede liposomer diametre &lt;100 - 400NM for å studere deres oppførsel på cellefunksjoner 3. Andre fokuserer på liposome-drug innkapsling, studerer liposomer som kjøretøy for å bære og levere et stoff av interesse 9. Drug innkapsling kan oppnås som rapporteres under liposome formasjon 9. Vår ekstrudering trinn skal ikke påvirke den innkapslede stoffet for to grunner, bør altså (1) narkotika innkapsling oppnås før dette trinnet og (2) liposomer bør beholde sin naturlige biofysisk stabilitet, sikkert bærer stoffet i vandig kjernen. Disse forskningsmål videre foreslå behovet for en optimalisert metode for å utforme stabile sub-mikron lipid blemmer. Likevel gjør gjeldende liposome forberedelse teknologier (10 sonikator, fryse-og-tine 10, sedimentasjon) ikke tillate utarbeidelse av liposomer med svært buet overflate (dvs. diameter &lt;100 nm) med høy konsistens og effektivitet 10,5, noe som begrenser biofysiske studier av en emerging felt av membran kurvatur sensing. Heri presenterer vi en robust forberedelse metode for en rekke av biologisk relevante liposomer. Manuell ekstrudering bruke gasstett sprøyter og polykarbonat membraner 10,5 er en vanlig praksis, men heterogeniteten blir ofte observert ved bruk porestørrelser &lt;100 nm på grunn på grunn av variasjon av manuelle trykket. Vi benyttet et konstant press kontrollert ekstrudering apparat for å forberede syntetiske liposomer som diametre varierer mellom 30 og 400 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) 10, elektronmikroskopi 11 og nanopartikkel sporing analyse (NTA) 12 ble brukt til å kvantifisere liposome størrelsene som beskrevet i protokollen vår, med kommersielle polystyren (PS) perler som brukes som en kalibrering standard. En nær lineær korrelasjon ble observert mellom de næringsdrivende porestørrelser og eksperimentelt bestemte liposomer, indikerer high fidelity av vår trykk-kontrollert liposome forberedelse møttHod. Videre har vi vist at dette lipid vesicle tilberedningsmetode gjelder generelt, uavhengig av ulike liposome størrelser. Til slutt har vi også vist i en tid kurs studie at disse preparerte liposomer var stabile i opptil 16 timer. En representant nanostørrelse liposome forberedelse protokollen er vist nedenfor.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Denne protokollen beskriver en ekstrudering metode for å forberede lipid vesikler av sub-mikrondimensjoner med en høy grad av homogenitet. Denne metoden bruker en trykk-kontrollert system med kontrollerte nitrogen strømningsrater for liposome forberedelse. Lipid forberedelse<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Vil liposome ekstrudering, og størrelse karakterisering bli presentert her.

Konstant trykk-kontrollert Extrusion Metode for utarbeidelse av nanostørrelse Lipid Blemmer

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret fremgangsmåte for fremstillingen av type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Utarbeidelse av Mica Støttet Lipid bilayers for High Resolution Optical Mikros Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembranen Fabrication av Løsemiddel assistert lipidbilag (SalB) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanopartikler (SLNs) for Intracellulær målretting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Film Ekstrudering av<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluering av lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantifisering av utvalgte kynureniner analysert av flytende kromatografi-massespektrometri i medium samlet fra kreftcellekulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...