Name: improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Forfatterne vil gerne takke Dr. Lubor Borsig (Institut for Fysiologi, Zürich Universitet) for hans råd om teknikken med lunge perfusion. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Krebsliga i Kanton Zürich, Walter L. og Johanna Wolf Foundation, Zürich, Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, den schweiziske National Science Foundation, SNF, Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist, og universitetet af Zürich.

1. In situ Lung Perfusion og Fiksering <ol><li> Bedøve musene ved ip injektion af ~ 150 pi phosphatpufret saltvand (PBS) indeholdende 112,5 mg / kg (legemsvægt) ketamin, 16,5 mg / kg xylazin og 15 mg / kg acepromazin (eller af en anden anæstesi indeholdende passende smertestillende medicin). </li><li> Når reflekser af musen ikke længere er overholdt, ordne det på operationsbordet back-ned og fugte pelsen med 70% Ethanol til smarte hårene ned. </li><li> Åbn hud fra maven op til halsen og trække den til siderne eller fjerne den. </li><li> Åbne peritoneum og brystkasse på en rigelig størrelse. Undgå brud af store fartøjer (f.eks vena jugularis) for at undgå nedsat effektivitet af den efterfølgende perfusion. </li><li> Skær vena cava caudalis under leveren. </li><li> Anvende en 20 ml sprøjte udstyret med en 21G - 24G nål til at injicere langsomt fra 10 til 15 ml PBS i den højre ventrikel af det slående hjerte, indtil lungerne er helt hvid oghjertet holder op med at slå (asystoli). </li><li> Nippes blodkar over leveren og membranen med en vaskulær klemme. </li><li> Brug en 10 ml sprøjte med en 21 G - 24G nål til at injicere ~ 2 ml 3% paraformaldehyd (PFA) i PBS ind i højre ventrikel. </li><li> Afdække luftrøret ydersiden af ​​brystkassen. Anvende den samme sprøjte til at injicere ~ 3 ml 3% PFA i PBS craniale (uden for brystkasse) i trachea indtil lungen er pustet op. Umiddelbart efter fjernelse af nålen, nippes luftrøret caudale af punktur med en vaskulær klemme, og vent i 10 minutter for at tillade fiksering. </li><li> Transektere blodkarrene over den vaskulære klemme, fjernes klemmen og injicer ~ 2 ml PBS i den højre ventrikel for at fjerne overskydende PFA. </li><li> Punktere de nedre dele af alle lungelapper med en nål, fjerner det vaskulære klemme på luftrøret og injicere 3-5 ml af en opløsning af PolyFreeze indstøbningsmedium / PBS 1:01 i trachea caudale af den første punktering indtil PFA i lungeLappe erstattes af løsningen. </li><li> Fjern lungen forsigtigt ved at trække i hjertet med en pincet og ved transecting bindevæv ligamenter, blodkar og trachea. Holde hjertet forbundet til lungerne. </li><li> Afhængigt af hvordan vi kommer videre med lungevævet analysen fortsætte med de protokoller, der er beskrevet i punkt 2 eller 3. Hvis du ønsker at gøre begge analyser, fjern en lunge lap og fortsæt som beskrevet under 3 år. Behandl de resterende kamre forbundet til hjertet som beskrevet under 2. </li></ol> 2. Visualisering af lacZ-tagged metastatiske tumorceller i Hele lungelapper <ol><li> Anbring lungen i en plastikkop med tætlukkende låg og fastgør den med 2% formaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 30-60 min. </li><li> Fjern fiksering opløsning og vaskes grundigt 3 gange med PBS. </li><li> Tilføje mindst 10 ml frisk fremstillet 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) farvningsopløsning (X-Gal stamopløsning [40 mg / ml iDimethylformamid] 1:40 fortyndet i Basic farvningsopløsning, pH 7,1 (tabel 1) beskyttet mod lys). </li><li> Sætte et stykke gaze på toppen af ​​svømning lunge at holde den fuldstændigt i opløsningen, og anbring låget kun løst på gryden til at tillade udveksling af luft. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i 3-5 timer beskyttet mod lys. </li><li> Fjern X-Gal løsning, skylles en gang med PBS for at fjerne resterende X-Gal opløsning (ekstraudstyr), og der tilsættes 4% PFA. </li></ol> 3. Visualisering af lacZ-mærkede metastatiske tumorceller i lunge kryosektioner <ol><li> Prefill et mærket indlejring støbeform til 1/3 med ufortyndet PolyFreeze indstøbningsmedium. Sæt lungelap oven og påfyld indstøbningsmedium indtil lap er fuldstændig dækket. Forsøger at undgå bobler. </li><li> Inkuber de indlejrede lungerne ved 4 ° C i 20 minutter. </li><li> Så fryse de integrerede lungerne langsomt i en blanding af tøris og Isopentan og opbevares ved -80 ° C. </li><li> Skær 7-10 um cryosektioner på en kryostat og montere dem på SuperFrostPlus mikroskopobjektglas. </li><li> Inkuber afsnittene umiddelbart med X-gal-farvning opløsning ved 37 ° C i 24 timer i et fugtigt kammer. </li><li> Skyl objektglassene i PBS 2 gange i 5 minutter og derefter kortvarigt i destilleret vand. </li><li> Counter-pletten med nukleare hurtigt rød i 10-30 sek, skyl i destilleret vand og montere dias med Immu-Mount. </li></ol> 4. Repræsentative resultater Asai et al. Rapporteret i den oprindelige artikel om Dunn-afledte GL8 OS musemodel, at SC primære tumorer afledt af de parentale Dunn celler, der er forskellige fra dem, der er afledt af den meget metastatisk GL8 sub cellelinie, ikke spontant danner påviselige lungemetastaser i syngene C3H-mus 14. Med de her rapporterede teknikker, undersøges igen vi dannelsen af ​​metastaser i Dunn/LM8 muse OS-modeller. Vi benyttede sig af stabil lacZ-transducerede Dunn og GL8 celles og af en protokol for in-situ lunge perfusion og fiksering i mus. Repræsentative billeder af perfunderede og ikke-perfunderede lunger fra mus subkutant injiceret med lacZ-transducerede og ikke-transducerede kontrol Dunn og GL8 celler er vist i figur 1.. I mus injiceret med kontrol Dunn-celler, forblev makroskopisk og mikroskopisk metastaser detekteres i ikke-perfunderede og perfunderede lunger (figur 1A, i-iv). Men interessant nok i mus injiceret med Dunn-lacZ-celler, afslørede X-gal-farvning blue micrometastatic foci af enkeltceller eller små celleklynger (&lt;0,1 mm) på overfladen af ikke-perfunderede lunger (figur 1A, vi). I situ perfusion og fiksering af lungerne forbedres yderligere påviseligheden af Dunn-lacZ mikrometastaser (figur 1A, viii). Der blev imidlertid udvækst til makroskopiske foci ikke observeret (figur 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; I mus injiceret med kontrol GL8 celler, gennemskinnelige, knap nok detekterbart macrometastatic foci større end 0,1 mm i diameter blev anerkendt i ikke-perfunderede lunger (figur 1B, i). Perfusion af lungen (figur 1 B, iii) forbedrede ikke påvisning af foci. I mus injiceret med GL8-lacZ-celler flere X-Gal stained blue makro-(figur 1B, v) og mikrometastaser (figur 1B, vi) blev detekteret på overfladen af ikke-perfunderede organer. Desuden perfusion af lungerne forbedres yderligere påviseligheden af makro-og mikrometastaser (figur 1B, vii - viii). Følgelig mikro-og macrometastases blev synlige ved en højere densitet og et større antal, hovedsagelig på grund af gennemskinnelighed af den gennemstrømmede væv, hvori foci under organ overflade blev også synlige. En yderligere histological analyse under anvendelse af kryosnit af lungevæv bekræftede den forbedrede spor af lungemetastaser i mus injiceret med lacZ-transducerede Dunn og GL8 celler. I mus med primære tumorer afledt af Dunn-lacZ eller GL8-lacZ-celler, blev i modsætning til mus med primære tumorer i de respektive kontrolceller, mikrometastaser eller endog enkelt celle foci anerkendt i lungesnit (figur 2). Desuden macrometastases var også mere tydeligt i mus injiceret med GL8-lacZ celler end i dyr injiceret med kontrol GL8 celler (figur 2C, D). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Fig. 1. Påvisning af spontane metastaser af ikke-transducerede (i-iv) og lacZ-transducerede (v-viii) Dunn (A) og GL8 (B) celler i ikke-perfunderede (I, II, V, VI) og perfunderede (III, IV, VII, VIII) lungerne i C3H-mus. Metastaser i repræsentative X-Gal-stained hele lungerne (V, VII i A og B) og respektive close-ups (VI, VIII i A og B) vises blå. Macrometastatic foci (&gt; 0,1 mm) med organer fra mus injiceret med ikke-mærkede GL8 celler (i-iv i B) er angivet med *. Områder vist i nærbilleder er repræsentative for hele lunger. Skala søjler angiver 1 mm i billeder af hele lunger og 0,1 mm i nærbilleder. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figur 2. Påvisning af Dunn og GL8 mikrometastaser i lunge kryosektioner. Sektioner af OCT indlejret lungevæv blev inkuberet i X-gal-farvning opløsning ved 37 ° C i 24 timer i et fugtigt kammer og derefter modfarvet med nuklear hurtig rød. Pile peger på micrometastatic foci anerkendt i lungesnit fra mus injiceret med Dunn-lacZ (B) eller GL8-lacZ celler (D). Micrometastases forblev upåviselig i lungesnit fra mus injiceret med ikke-transducerede Dunn (A) eller GL8 celler (C). Skala bjælker angiver 0,1 mm.

<ol>
	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

De her præsenterede resultater i Dunn/LM8 muse OS model demonstrere magt af den nyligt etablerede metode, der kombinerer X-Gal farvning af lacZ-mærkede tumorceller med in-situ perfusion / fiksering af lungevæv. Denne kombination af de to teknikker giver høj følsomhed påvisning af micrometastatic læsioner ned til enkeltcelle-niveau og også forbedrer visualiseringen af macrometastases på lungeoverfladen (fig. 1) samt i lungesnit (fig. 2). Mens X-gal-farvning tillader også påvisning af (mikro) metastaser i andre organer, in situ perfusion / fiksering forbedrer detekterbarheden af metastatiske foci i andre væv end lungen kun lidt på grund af den naturlige blod-og vævs-relateret farve af disse organer 13. Selv om perfusionen angår et andet organ, fx leveren, vil fjernelse af blodet kun delvis forbedre kontrasten betlem X-gal-farvning, og den naturlige farve af organet. Men den kan anvendes på enhver type af lacZ-mærkede tumorceller, vil dramatisk forbedre detekterbarheden af lungemetastase ned til niveauet af hvilende encellede mikrometastaser og muliggør en nem og pålidelig kvantificering af makro-og mikrometastaser. En begrænsning ved denne fremgangsmåde og alle andre teknikker, der er baseret på reportergener, herunder luciferase og fluorescerende proteiner, er stabiliteten af ​​transgen ekspression. Som vist i figur 2d er ikke alle tumorceller i macrometastatic foci farves blå, hvilket indikerer en mangel på beta-galactosidaseaktivitet. Dette kan være relateret til nekrose, men det er mere sandsynligt på grund af et tab af transgen ekspression. Vi observerede, at Dunn og GL8 celler er meget effektive i nedregulering af lacZ og andre transgener selv under kontinuerlig selektion for ekspression. Vi skiftede derfor i de seneste undersøgelser for murin K12og K7M2 og de ​​menneskelige HOS, 143B og Saos-2 osteosarcom-cellelinier, som alle holdes stabilt lacZ-ekspression in vitro og in vivo op til 100% over tid. Når stabil lacZ-ekspression er garanteret, kan denne teknik anvendes i studier med gen-manipulerede tumorceller, bl.a. for at mekanistisk undersøge processen med væv kolonisering 13 samt til udvikling og afprøvning af nye behandlingsformer med henblik på udryddelse af metastatiske læsioner 15 af 16. Desuden kan det tjene som et benchmark for forbedring af den aktuelle radiologiske billeddannende teknikker, såsom PET, (mikro) CT og MR, der anvendes til tidlig påvisning af metastatiske læsioner. I en nylig undersøgelse PET (ikke offentliggjort) med forskellige sporstoffer, vi verificeret in vivo påvist lungemetastaser efterfølgende ex vivo med den beskrevne protokol. I en igangværende undersøgelse med en ny lille dyr mikro-CT (SkyScan) vi er så langt ABle til påvisning af lungemetastaser in vivo ned til en størrelse på 0,5 mm og ex vivo ned til 0,3 mm, men man sigte på en opløsning på 0,1 mm. Interessant er det størrelsesgrænse, vi sat til at skelne makro-fra micrometastases ved den kombinerede fremgangsmåde til in-situ perfusion og X-gal-farvning. Dette understreger igen følsomheden og nytten af ​​denne nemme og omkostningseffektiv teknik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamin) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml opløsning </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazin) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml opløsning </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazin) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml opløsning </td></tr><tr><td> Bulldog Type Serrefine vaskulær klemme </td><td> Fin Science Tools </td><td> 18.051-35 </td><td> buede, 35 mm </td></tr><tr><td> Plastic kop med låg </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml kopper med låg </td></tr><tr><td> 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal); pulver </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> opløses i N, N-di-methylformamid til 40 mg / ml, opbevare lys-beskyttet ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Basisk farvningsopløsning, ækvilibreret til pH 7,1, opbevaret lys-beskyttet ved 4 ° C for max. 1 måned </td><td> self-made </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCI2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% natrium-deoxycholat </td></tr><tr><td> PolyFreeze indstøbningsmediet </td><td> Polysciences, swiss distributør: Brunschwig </td><td> 19.636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Indlejring skimmel </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 kryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost dias </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - aluminiumsulfatopløsning </td><td> Division Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, swiss distributør: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagenser og udstyr.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metastase er den vigtigste dødsårsag i de fleste kræftformer og dermed en hovedfokus i kræftforskning. Men påvisning af micrometastases af radiologisk billeddannelse og succes i deres terapeutiske udryddelse er stadig begrænset. Mens dyremodeller har vist sig at være uvurderlige værktøjer for kræftforskning 1, overvågning / visualisering af micrometastases fortsat en udfordring og unøjagtig vurdering af metastatisk spredning i prækliniske studier potentielt fører til skuffende resultater i kliniske forsøg 2. Der er derfor stor interesse for raffinering fremgangsmåderne til endelig at muliggøre reproducerbar og pålidelig detektion af metastaser ned til enkeltcelle-niveauet i normalt væv. Det primære fokus er derfor på teknikker, som muliggør påvisning af tumorceller in vivo, såsom mikro-computer tomografi (micro-CT), positronemissionstomografi (PET), bioluminescens eller fluorescensimagografi &lt;sup&gt; 3,4. Vi i øjeblikket at optimere disse teknikker til in vivo monitorering af primær tumorvækst og metastase i forskellige osteosarkom modeller. Nogle af disse teknikker kan også anvendes for ex vivo analyse af metastase ved siden af klassiske metoder som qPCR 5, FACS 6 eller forskellige histologisk farvning. Som benchmark, har vi etableret i den foreliggende undersøgelse den stabile transfektion eller transduktion af tumorceller med lacZ-genet koder for det bakterielle enzym β-galactosidase, som metaboliserer det kromogene substrat 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D -galactopyranosid (X-Gal) til en uopløselig indigo blåt farvestof 7 og tillader meget følsom og selektiv histokemisk blåfarvning af tumorceller i musevæv ex vivo ned til enkeltcelleniveau som vist her. Dette er en billig og ikke udstyr-intensive værktøj, som muliggør en præcis validering af metastase 8 i undersøgelser vurderer ny enticancer terapier 9-11. En begrænsende faktor af X-gal-farvning er lav kontrast til fx blod-relateret rødfarvning af godt vaskulariserede væv. I lungevæv dette problem kan løses ved in-situ lunge perfusion, en teknik, der for nylig blev indført ved Borsig et al. 12, der perfunderet lungerne på mus under anæstesi at fjerne dem fra blodet og at fastsætte og indlejre dem in situ under inflation gennem luftrøret. Denne metode forhindrer også sammenbrud af lungen og derved fastholder morfologien af ​​funktionelle lungealveolerne, hvilket forbedrer kvaliteten af ​​det væv til histologisk analyse. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en ny protokol, som udnytter en kombination af X-gal-farvning for lacZ-udtrykkende tumorceller og in situ perfusion og fiksering af lungevæv. Denne raffinerede protokol giver mulighed for høj følsomhed detektion af enkelte metastatiske celler i lungerne og aktiveret os i en nylig undersøgelse til detect &quot;sovende&quot; lunge mikrometastaser i en musemodel 13, som oprindeligt blev beskrevet at være ikke-metastatisk 14.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Den hidtil ukendte protokol beskrevet i den foreliggende undersøgelse tillader selektiv detektion af lungemetastaser ved enkeltcelle-opløsning i mus efter kombineret<em&gt; In-situ</em&gt; Lunge perfusion og fiksering og X-gal-farvning af<em&gt; LacZ</em&gt;-Mærkede tumorceller.

Forbedret Visualisering af lungemetastaser ved Single Cell Opløsning i mus ved kombinerede<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion af lungevæv og X-gal-farvning af<em&gt; LacZ</em&gt;-Mærkede tumorceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metode til isoleret<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en rotte Model: Erfaringer fra at udvikle en rotte EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primær tumor og MEF Cell Isolation at studere Lung Metastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Hjertekateterisation i mus til at måle trykket Volume Forholdet: Undersøgelse af Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluering af lungemetastase i musebrysttumor modeller af kvantitativ real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åbent Tracheostomituber Gastric Acid Aspiration murin model af akut lungeskade Resultater i Maximal Akut ikke-letale Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-associeret Virus-medieret levering af CRISPR for hjerte gen redigering i mus

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Generation af menneskelige 3D lungevæv kulturer (3D-LTCs) for sygdommen modellering

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analyse af cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner af glat muskel celle afstamning sporingen mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducerende akut lungeskade i mus ved direkte Intratracheal Lipopolysaccharid instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vurdering af de luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding ved at udsætte dyrkede humane lungeceller ved luftflydende interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...